Il meta-cleavage pathway di Pseudomonas sp. OX1: regolazione trascrizionale e studi di attività enzimatiche

Abstract

Il rilascio nell’ambiente di composti di natura aromatica, che tendono ad accumularsi a causa della loro stabilità, rappresenta uno degli aspetti più importanti nell’ambito delle problematiche di biorisanamento. I principali inquinanti di natura aromatica sono componenti del petrolio e dei suoi derivati, che trovano ampio utilizzo come solventi o come precursori per la produzione di numerosi composti chimici. Poiché la distribuzione di questi inquinanti nell’ambiente è ubiquitaria e il loro effetto sull’uomo è estremamente nocivo, risulta chiaro il sempre maggiore interesse nello sviluppo di processi per la loro biodegradazione. Tra gli idrocarburi aromatici si trovano semplici molecole come toluene e xileni, anelli sostituiti contenenti gruppi alo- e nitro-, ma anche molecole molto più complesse come gli idrocarburi aromatici policiclici. La degradazione biologica dei composti chimici tossici e recalcitranti come gli idrocarburi aromatici rappresenta un’alternativa attraente ai metodi convenzionalmente usati per lo smaltimento degli inquinanti. Molti microrganismi naturalmente presenti nel suolo e nelle acque hanno evoluto vie metaboliche per sopravvivere in presenza di composti chimici altrimenti tossici; nonostante ciò ancora un elevato numero di molecole aromatiche risulta essere recalcitrante alla biodegradazione. La conoscenza sempre più approfondita della struttura e della funzione delle vie metaboliche coinvolte nella biodegradazione di inquinanti ambientali, insieme alle tecniche di ingegneria genetica, offrono la possibilità di creare enzimi con una aumentata attività catalitica o di accelerare l’evoluzione di una via metabolica capace di degradare uno o una famiglia di composti aromatici recalcitranti. I batteri appartenenti al genere Pseudomonas rappresentano il gruppo più vasto di microrganismi in grado di utilizzare, in condizioni aerobiche, molti composti aromatici ed alifatici come unica fonte di carbonio ed energia. Pseudomonas sp. OX1 mostra differenti funzioni rilevanti per la decontaminazione ambientale: ha la capacità di metabolizzare o-xilene, toluene, benzene, fenolo, 2,3- e 3,4- dimetilfenoli ed i cresoli, ma non è capace di utilizzare m- e p-xilene come fonte di carbonio ed energia. I geni codificanti gli enzimi per il catabolismo del toluene e di o-xilene sono organizzati, nel cromosoma di P. sp. OX1, in due operoni: uno, l’operone tou (toluene oxylene utilization) codifica un complesso multienzimatico chiamato ToMO (Toluene o-xilene MonoOssigenasi); l’altro, l’operone phe, comprende un cluster genico codificante le varie subunità di una Fenolo Ossidrilasi (PH) e, a valle, i geni codificanti gli enzimi del lower-meta pathway. I complessi multienzimatici ToMO e PH catalizzano le reazioni dell’upper pathway: i prodotti finali delle attività di ToMO e PH (catecoli metil-sostituiti) vanno incontro ad una successiva degradazione mediante il lower-meta pathway con formazione di intermedi del ciclo degli acidi tricarbossilici. Molte informazioni sono già disponibili relativamente ai loci codificanti ToMO e PH: i due complessi ricombinanti sono stati ricostituiti ed espressi in vitro, dimostrando la loro attività enzimatica, dal gruppo di ricerca del Prof. Di Donato dell’Università Federico II di Napoli. La caratterizzazione del lower-meta pathway, invece, non è stata ancora completata. È stato dimostrato che l’operone phe ha un’organizzazione genica omologa all’operone dmp (dimethyl- phenol) di Pseudomonas sp. CF600. Il gruppo di ricerca del Prof. Di Donato ha espresso, caratterizzato e purificato gli enzimi coinvolti nelle prime reazioni del meta pathway: la catecolo 2,3 diossigenasi (C2,3O), codificata dal gene pheB, la semialdeide 2- idrossimuconica deidrogenasi (HMSD), codificata dal gene pheC, e la semialdeide 2- idrossimuconica idrolasi (HMSH), codificata dal gene pheD. La C2,3O catalizza la reazione di apertura dell’anello aromatico dei catecoli derivati dall’upper pathway: l’apertura dell’anello del catecolo avviene sempre in posizione extradiolica con produzione di semialdeide 2-idrossimuconica (HMS). Gli enzimi HMSD e HMSH hanno come substrato i prodotti del taglio della C2,3O. Il sequenziamento dei geni del meta pathway, per la completa caratterizzazione dell’operone phe, è stato portato a termine dal gruppo della Prof.ssa Carla Caruso dell’Università degli Studi della Tuscia di Viterbo: è stata delucidata la sequenza degli ultimi geni pheG,F,H,I codificanti la 4-idrossi-2-oxovalerato aldolasi (HOA) e l’aldeide deidrogenasi (acetilasi) (ADA) (geni pheG e pheF), la 4-oxalocrotonato decarbossilasi (4OD) e la 4-oxalocrotonato isomerasi (4OI) (geni pheH e pheI). L’esistenza di un elevato grado di identità tra le sequenze polipeptidiche dedotte delle proteine ADA e HOA phe di P. sp. OX1 e le sequenze polipeptidiche degli enzimi omologhi DmpF e DmpG di P. sp. CF600, di cui sono note le strutture cristallografiche disponibili in internet nella banca dati PDB, ha dato la possibilità di effettuare analisi di homology modeling procedendo nella caratterizzazione strutturale attraverso la realizzazione dei modelli tridimensionali delle due proteine. Il lavoro descritto in questa tesi di dottorato ha come obiettivo la caratterizzazione biochimica degli enzimi ADA ed HOA del lower-meta pathway di Pseudomonas sp. OX1 e la delucidazione del meccanismo trascrizionale da cui dipende l’espressione dei geni phe. Le proteine ADA e HOA si associano in un complesso enzimatico bifunzionale grazie al quale il prodotto dell’aldolasi HOA, l’acetaldeide, è incanalata direttamente verso il sito attivo di ADA, proteggendo la cellula dalla sua tossicità. La deidrogenasi ADA richiede come cofattori NAD+ e CoA per trasformare l’acetaldeide in acetil-CoA. Quest’ultimo e il piruvato, prodotto da HOA insieme all’acetaldeide, sono i prodotti finali del pathway che verranno incanalati nel ciclo degli acidi tricarbossilici. La caratterizzazione funzionale degli enzimi ADA ed HOA coinvolti in questo evento di channeling enzimatico è iniziata con la costruzione di un sistema eterologo per la produzione delle proteine ricombinanti in E. coli. Successivamente è stata realizzata la loro purificazione e lo studio dei loro parametri cinetici. La caratterizzazione delle proteine ricombinanti e l’analisi delle proprietà catalitiche dell’enzima bifunzionale pheADA-HOA è importante, insieme alla struttura 3D predetta, per realizzare una fine correlazione strutturafunzione. Pseudomonas sp. OX1 è capace di crescere utilizzando o-xilene come unica fonte di carbonio ma non è capace di metabolizzare m- e p-xilene. A partire da questi due isomeri dello xilene ToMO e PH catalizzano la progressiva ossidazione dell’anello aromatico per dare 3,5- e 3,6-dimetilcatecoli che non vengono metabolizzati dalla C2,3O, risultando tossici per la cellula. Ciononostante, Pseudomonas sp. OX1 conserva nel suo cromosoma i geni per il catabolismo di m- e p-xilene omologhi ai geni xyl del plasmide TOL di Pseudomonas putida mt-2, un ceppo che normalmente utilizza questi composti come substrati di crescita. In ambienti contaminati dai due isomeri dello xilene sono stati isolati mutanti spontanei di Pseudomonas sp. OX1 in grado di attaccare tali composti ma non l’o-xilene: il catabolismo procede mediante il TOL pathway attraverso la progressiva ossidazione del gruppo metilico che porta a metilcatecoli non letali. Si ritiene che i geni xyl siano stati acquisiti in seguito al trasferimento di un trasposone catabolico: nel ceppo wild-type tale operone è inattivato da una sequenza di inserzione impedendo la crescita su m- e p-xilene, mentre nel mutante la sequenza di inserzione traspone nel locus codificante ToMO bloccando l’utilizzo dell’oxilene. Nel corso di questo dottorato di ricerca è stato realizzato l’isolamento dei geni xyllikeQK codificanti l’aldeide deidrogenasi (acetilasi) ADA e l’aldolasi HOA, omologhi ai geni xyl di Pseudomonas putida mt-2. In seguito è stata affrontata la caratterizzazione funzionale degli enzimi xyl-like ADA ed HOA a partire dalla costruzione di un sistema eterologo per la produzione delle proteine ricombinanti in E. coli. Dopo la loro purificazione e lo studio dei parametri cinetici, la caratterizzazione dell’enzima bifunzionale xyl-like ADA-HOA è proseguita in uno studio di homology modeling che ha portato alla realizzazione della struttura 3D del complesso enzimatico. Nei microrganismi, la capacità di attivare o silenziare in maniera estremamente rapida l’espressione di vie metaboliche differenti è fondamentale per l’adattamento ad un ambiente mutevole, assicurando la performance non solo della singola cellula, ma anche della popolazione batterica e perfino della comunità microbica. I promotori batterici possono processare vari segnali fisico-chimici e metabolici per regolare la loro attività: in particolare tali segnali sono mediati da specifiche proteine di regolazione. Molti operoni per il catabolismo dei composti aromatici sono regolati attraverso un circuito s54dipendente. La RNA polimerasi contenente il fattore alternativo s54 riconosce e lega una classe di promotori caratterizzata dalla presenza di motivi GG e GC nelle posizioni -24 e -12, rispettivamente. Elementi definiti enhancer-like o UASs (Upstream Activating Sequences), localizzati a circa 100 o 200 bp a monte delle sequenze -12/-24, sono le regioni a cui si legano le proteine di regolazione. La s54-RNAP forma complessi chiusi stabili con il promotore ma è incapace di catalizzare l’isomerizzazione verso il complesso aperto che avvia la trascrizione. L’isomerizzazione si realizza solo in seguito all’interazione con un attivatore trascrizionale appartenente alla classe NtrC-like. Questi attivatori presentano tre domini strutturali e funzionali: il dominio amino-terminale A, che riconosce e lega la molecola aromatica come effettore; il dominio carbossi-terminale D che lega il DNA, e il dominio centrale C con attività ATPasica. In assenza dell’effettore, il dominio A agisce come repressore intramolecolare bloccando il regolatore in una forma inattiva; l’interazione tra il dominio A e la specifica molecola effettrice rimuove questo blocco, permettendo il passaggio alla forma attiva capace di interagire con il DNA e la s54-RNAP, promuovendo così la trascrizione. È noto il meccanismo che regola l’espressione dei geni tou: un regolatore trascrizionale appartenente alla famiglia degli attivatori NtrC-like, detto TouR, controlla positivamente l’espressione di ToMO. Pseudomonas sp. OX1 è il primo ceppo che degrada il toluene in cui un operone codificante una toluene-monoossigenasi (tou operon) è stato trovato associato ad un operone dmp-like (phe operon). La presenza dell’operone phe e di un regolatore responsivo a fenolo e metil-fenoli (TouR) nel genoma di Pseudomonas sp. OX1 suggerisce che, in questo ceppo, la via per il catabolismo di toluene e di o-xilene si sia evoluta in seguito ad un evento di espansione verticale che ha portato all’incorporazione del cluster genico tou in una via preesistente per il catabolismo del fenolo. Considerando valida l’ipotesi che il locus tou sia stato acquisito nel genoma di Pseudomonas sp. OX1 in seguito ad un evento di espansione di una via catabolica preesistente, si ritiene che anche l’espressione dell’operone phe sia sotto il controllo di un promotore s54-dipendente e che possa essere regolata positivamente da TouR o da un attivatore appartenente alla stessa famiglia. Un ulteriore obiettivo della ricerca è l’isolamento e la caratterizzazione della regione promotrice Pphe. La regione 5’ non tradotta dell’operone phe di Pseudomonas sp. OX1 è stata isolata e caratterizzata. Successivamente sono stati realizzati un serie di esperimenti che hanno portato all’isolamento e all’identificazione di un putativo fattore di regolazione dell’espressione del phe operon. La capacità mostrata da Pseudomonas sp. OX1 di crescere su diversi substrati aromatici, insieme alla possibilità di esprimere geni silenti in risposta a cambiamenti delle condizioni ambientali, conferisce a questo microrganismo una straordinaria versatilità metabolica che lo rende un candidato ottimale da impiegare nell’ambito del biorisanamento ambientale.

The release of aromatic compounds in the environment, which accumulate due to their stability, is one of the most important issues in bioremediation. The main pollutants in nature are components of petroleum and its refined products, which find wide use as solvents or as precursors for the production of several chemical compounds. Since the distribution of these pollutants in the environment is ubiquitous and their effect on humans health is extremely harmful, it is clear the increasing interest in developing processes for their biodegradation. Among the aromatic hydrocarbons are simple molecules such as toluene and xylenes, rings replaced alo- and nitro-containing groups, but also much more complex molecules as polycyclic aromatic hydrocarbons. The biodegradation of toxic and recalcitrant chemicals, such as the aromatic hydrocarbons, represents an attractive alternative to conventionally used methods for the disposal of pollutants. Many genera of microorganisms, naturally present in soil and water, evolved metabolic pathways to survive in the presence of otherwise toxic chemicals; nevertheless still a large number of aromatic molecules appear to be recalcitrant to biodegradation. The thorough knowledge of the structure and function of metabolic pathways involved in the biodegradation of environmental pollutants, along with genetic engineering, offers the ability to create enzymes with an increased catalytic activity or to accelerate the evolution of a metabolic pathway that can degrade only one compound or a whole family of aromatic recalcitrant compounds. The bacteria belonging to the genus Pseudomonas represent the largest group of microorganisms able to use, under aerobic conditions, many aromatic and aliphatic compounds as the sole carbon and energy source. Pseudomonas sp. OX1 shows relevant functions to the environmental decontamination; it has the ability to metabolize o-xylene, toluene, benzene, phenol, 2,3- and 3,4- dimethylphenol and cresols, but it is not able to use m-and p-xylene as carbon and energy source. The genes coding for toluene and o-xylene catabolism are localized in the chromosome of P. sp. OX1 and they are organized into two operons: the tou operon (toluene o-xylene utilization) encodes a multienzymatic complex called ToMO (Toluene o-xylene Monoxygenase); the phe operon includes a gene cluster coding the subunits of a Phenol Hydroxylase (PH) and the enzymes of the lower-meta pathway. ToMO and PH catalyze upper pathway reactions: the final products of ToMO and PH activities (methyl-substituted catechols) undergo a further degradation through the lower-meta pathway, leading to intermediate of the tricarboxylic acid cycle. pathway, leading to intermediate of the tricarboxylic acid cycle. Many informations are available for ToMO and PH. The two recombinant complexes were reconstituted and expressed in vitro, demonstrating their enzymatic activity, by the Prof. Di Donato team from Federico II University in Naples. The characterization of the lower-meta pathway has not yet been completed. It was shown that the phe operon has an homologous genetic organization to dmp operon (di-methylphenol operon) of Pseudomonas sp. CF600. The research group previously mentioned also expressed, purified and characterized the enzymes involved in the initial reactions of the meta pathway: the catechol 2,3 dioxygenase (C2,3O), encoded by the pheB gene, the 2- dehydrogenase (HMSD), encoded by the pheC gene, and the 2- hydroxymuconic semialdehyde hydrolase (HMSH), encoded by the pheD gene. The C2,3O catalyzes the extradiolic aromatic ring cleavage reaction of upper pathway catechol derivatives, with production of 2-hydroxymuconic semialdehyde (HMS). The meta cleavage products are metabolized by HMSD or by HMSH. The sequencing of the meta pathway genes, for the phe operon complete characterization, was completed by the group of Prof. Carla Caruso of the University of Tuscia in Viterbo. The sequence of pheGFHI genes has been elucidated: they encode the 4- Hydroxy-2-oxovalerate Aldolase (HOA) and the Aldehyde dehydrogenase (acylating) (ADA) (pheG and pheF genes), the 4-Oxalocrotonate Decarboxylase (4OD) and the 4-Oxalocrotonate Isomerase (4OI) (pheH and pheI genes). An high degree of identity is between the aminoacidic sequences of ADA and HOA enzymes from P. sp. OX1 and the corresponding DmpF and DmpG enzymes characterized in P. sp. CF600; moreover, the crystallographic structures of DmpF and DmpG are available on the PDB (Protein Data Bank) database. Therefore, was performed an homology modeling study to realize the three-dimensional models of the two proteins for their structural characterization. The aims of this thesis are biochemical characterization of lower-meta pathway ADA and HOA enzymes from Pseudomonas sp. OX1 and the elucidation of the transcriptional mechanism by which the phe genes expression is regulated. ADA and HOA are associated in a bifunctional enzyme complex by which the HOA product, acetaldehyde, is channeled directly into the ADA active site, protecting the cell from its toxicity. ADA requires NAD + and CoA as cofactors to turn acetaldehyde into acetyl-CoA. Pyruvate and acetyl-CoA are the final products of the pathway and they will be channeled into tricarboxylic acid cycle. The functional characterization of ADA and HOA enzymes involved in this channelling, begins with the construction of a heterologous system for the production of recombinant proteins in E. coli and it is continued with the purification and the study of their kinetic parameters. The characterization of recombinant proteins and the analysis of their catalytic properties, together with the predicted 3D structure, will to achieve a fine structure function correlation. Pseudomonas sp. OX1 is able to grow using o-xylene as the sole carbon source but it is not able to metabolize m-and p-xylene. From these two isomers of xylene, ToMO and PH catalyze the oxidation of the aromatic ring to give 3,5- and 3,6-dimethylcatechols, that are not metabolized by C2,3O, resulting toxic to the cell. However, Pseudomonas sp. OX1 retains genes for the catabolism of m- and p-xylene, omologs to xyl genes of the TOL plasmid of Pseudomonas putida mt-2, a strain that normally uses these compounds as growth substrates. In environments contaminated by the two isomers of xylene, spontaneous mutant of Pseudomonas sp. OX1 able to metabolized these compounds, but not the o-xylene, have been isolated: the catabolism proceeds through the TOL pathway, through the progressive oxidation of methyl group that leads to not lethal methylcatechols. It is believed that xyl genes have been acquired by a catabolic transposons: in wild-type strain that operon is inactivated by an insertion sequence, preventing the growth on m- and p-xylene; in the mutants, the insertion sequence transposes in the locus coding ToMO, blocking the use of o-xylene. During this work, were isolated the genes coding xyl-like enzymes: the Aldehyde dehydrogenase (acylating) ADA and the Aldolase HOA, corresponding to the xylQK genes from Pseudomonas putida mt-2. We created an heterologous system for the production of recombinant proteins in E. coli. After their purification and the study of kinetic parameters, we characterized Xyl-like ADA-HOA bifunctional enzyme structure by an homology modeling study to create the 3D structure of the enzyme complex. In microorganisms, the ability to readily activate or silence the expression of different metabolic pathways is essential for adapting to a changing environment, ensuring the performance not only of the single cell, but also of population and even of the microbial community. Promoters have to process different physicochemical and metabolic signals to regulate their activities: those signals are mediated by specific regulatory proteins. Many operons for the catabolism of aromatic compounds are regulated by means of s54-dependent circuit. The RNA polymerase (RNAP) containing the alternative sigma factor s54 recognizes and binds a class of promoters, which are characterized by GG and GC motifs at positions -24 and -12, respectively. Enhancer-like elements or UASs (Upstream Activating Sequences), located about 100 or 200 bp upstream of -12/-24 regions, represent the binding site of regulatory proteins. The s54-RNAP forms stable closed complexes with the promoter and is unable to catalyze the isomerization to the open complex initiating transcription. The isomerization takes place only upon interaction with an NtrC-like transcriptional activator. These activators have three structural and functional domains: the amino-terminal A domain, which recognizes and binds effector molecules; the carboxy-terminal D domain that binds the DNA, and the central C domain with ATPase activity. In the absence of effectors, the A domain acts as an intramolecular repressor, blocking the regulator in an inactive form; the interaction between the A domain and the specific effector removes this repression, leading to the active form, able to interact with DNA and s54-RNAP and promoting transcription. We know the mechanism that regulates the expression of tou genes: a transcriptional regulator belonging to the family of activators NtrC-like, TouR, positively controls the expression of ToMO. Pseudomonas sp. OX1 is the first strain that degrades toluene in which the toluene-monooxygenase encoding operon (tou operon) has been found associated to a dmp-like operon (phe operon). The presence of a dmp-like operon (phe operon) together with a phenol responsive regulator (TouR) suggests that, in this strain, the toluene and o-xylene catabolic pathway evolved by vertical expansion which led to the incorporation of the tou gene cluster in a preexisting route for phenol catabolism. This observation suggest that the phe operon expression is under the control of a σ54-dependent promoter and can be regulated positively by TouR or another activator belonging to the same family. A further objective of this research is the isolation and characterization of the Pphe promoter region. The phe operon 5' non-translated region of Pseudomonas sp. OX1 was isolated and characterized. Were subsequently made a series of experiments that led to isolation and identification of a putative regulation factor of the phe operon. The ability shown by Pseudomonas sp. OX1 to grow on different aromatic substrates with the ability to express otherwise silent genes in response to changes in environmental conditions, gives an extraordinary metabolic versatility that makes this strain an ideal candidate to be used in bioremediation.