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Title: Il meta-cleavage pathway di Pseudomonas sp. OX1: regolazione trascrizionale e studi di attività enzimatiche
Authors: Stancarone, Valeria
Keywords: Pseudomonas;Bioremediation;ADA aldehyde dehydrogenase (Acylating);HOA 4-hydroxy-2-oxalocrotonate aldolase;Pphe promoter;Regolatori NtrC-like;Protein expression;BIO/11
Issue Date: 20-Feb-2009
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 21. ciclo
Abstract: 
Il rilascio nell’ambiente di composti di natura aromatica, che tendono ad accumularsi a
causa della loro stabilità, rappresenta uno degli aspetti più importanti nell’ambito delle
problematiche di biorisanamento. I principali inquinanti di natura aromatica sono componenti
del petrolio e dei suoi derivati, che trovano ampio utilizzo come solventi o come precursori
per la produzione di numerosi composti chimici. Poiché la distribuzione di questi inquinanti
nell’ambiente è ubiquitaria e il loro effetto sull’uomo è estremamente nocivo, risulta chiaro il
sempre maggiore interesse nello sviluppo di processi per la loro biodegradazione.
Tra gli idrocarburi aromatici si trovano semplici molecole come toluene e xileni, anelli
sostituiti contenenti gruppi alo- e nitro-, ma anche molecole molto più complesse come gli
idrocarburi aromatici policiclici. La degradazione biologica dei composti chimici tossici e
recalcitranti come gli idrocarburi aromatici rappresenta un’alternativa attraente ai metodi
convenzionalmente usati per lo smaltimento degli inquinanti. Molti microrganismi
naturalmente presenti nel suolo e nelle acque hanno evoluto vie metaboliche per sopravvivere
in presenza di composti chimici altrimenti tossici; nonostante ciò ancora un elevato numero di
molecole aromatiche risulta essere recalcitrante alla biodegradazione.
La conoscenza sempre più approfondita della struttura e della funzione delle vie
metaboliche coinvolte nella biodegradazione di inquinanti ambientali, insieme alle tecniche di
ingegneria genetica, offrono la possibilità di creare enzimi con una aumentata attività
catalitica o di accelerare l’evoluzione di una via metabolica capace di degradare uno o una
famiglia di composti aromatici recalcitranti.
I batteri appartenenti al genere Pseudomonas rappresentano il gruppo più vasto di
microrganismi in grado di utilizzare, in condizioni aerobiche, molti composti aromatici ed
alifatici come unica fonte di carbonio ed energia.
Pseudomonas sp. OX1 mostra differenti funzioni rilevanti per la decontaminazione
ambientale: ha la capacità di metabolizzare o-xilene, toluene, benzene, fenolo, 2,3- e 3,4-
dimetilfenoli ed i cresoli, ma non è capace di utilizzare m- e p-xilene come fonte di carbonio
ed energia. I geni codificanti gli enzimi per il catabolismo del toluene e di o-xilene sono
organizzati, nel cromosoma di P. sp. OX1, in due operoni: uno, l’operone tou (toluene oxylene
utilization) codifica un complesso multienzimatico chiamato ToMO (Toluene o-xilene
MonoOssigenasi); l’altro, l’operone phe, comprende un cluster genico codificante le varie
subunità di una Fenolo Ossidrilasi (PH) e, a valle, i geni codificanti gli enzimi del lower-meta
pathway.
ii
I complessi multienzimatici ToMO e PH catalizzano le reazioni dell’upper pathway: i
prodotti finali delle attività di ToMO e PH (catecoli metil-sostituiti) vanno incontro ad una
successiva degradazione mediante il lower-meta pathway con formazione di intermedi del
ciclo degli acidi tricarbossilici.
Molte informazioni sono già disponibili relativamente ai loci codificanti ToMO e PH: i
due complessi ricombinanti sono stati ricostituiti ed espressi in vitro, dimostrando la loro
attività enzimatica, dal gruppo di ricerca del Prof. Di Donato dell’Università Federico II di
Napoli. La caratterizzazione del lower-meta pathway, invece, non è stata ancora completata. È
stato dimostrato che l’operone phe ha un’organizzazione genica omologa all’operone dmp (dimethyl-
phenol) di Pseudomonas sp. CF600. Il gruppo di ricerca del Prof. Di Donato ha
espresso, caratterizzato e purificato gli enzimi coinvolti nelle prime reazioni del meta
pathway: la catecolo 2,3 diossigenasi (C2,3O), codificata dal gene pheB, la semialdeide 2-
idrossimuconica deidrogenasi (HMSD), codificata dal gene pheC, e la semialdeide 2-
idrossimuconica idrolasi (HMSH), codificata dal gene pheD. La C2,3O catalizza la reazione
di apertura dell’anello aromatico dei catecoli derivati dall’upper pathway: l’apertura
dell’anello del catecolo avviene sempre in posizione extradiolica con produzione di
semialdeide 2-idrossimuconica (HMS). Gli enzimi HMSD e HMSH hanno come substrato i
prodotti del taglio della C2,3O.
Il sequenziamento dei geni del meta pathway, per la completa caratterizzazione
dell’operone phe, è stato portato a termine dal gruppo della Prof.ssa Carla Caruso
dell’Università degli Studi della Tuscia di Viterbo: è stata delucidata la sequenza degli ultimi
geni pheG,F,H,I codificanti la 4-idrossi-2-oxovalerato aldolasi (HOA) e l’aldeide
deidrogenasi (acetilasi) (ADA) (geni pheG e pheF), la 4-oxalocrotonato decarbossilasi (4OD)
e la 4-oxalocrotonato isomerasi (4OI) (geni pheH e pheI).
L’esistenza di un elevato grado di identità tra le sequenze polipeptidiche dedotte delle
proteine ADA e HOA phe di P. sp. OX1 e le sequenze polipeptidiche degli enzimi omologhi
DmpF e DmpG di P. sp. CF600, di cui sono note le strutture cristallografiche disponibili in
internet nella banca dati PDB, ha dato la possibilità di effettuare analisi di homology modeling
procedendo nella caratterizzazione strutturale attraverso la realizzazione dei modelli
tridimensionali delle due proteine.
Il lavoro descritto in questa tesi di dottorato ha come obiettivo la caratterizzazione
biochimica degli enzimi ADA ed HOA del lower-meta pathway di Pseudomonas sp. OX1 e la
delucidazione del meccanismo trascrizionale da cui dipende l’espressione dei geni phe.
Le proteine ADA e HOA si associano in un complesso enzimatico bifunzionale grazie
al quale il prodotto dell’aldolasi HOA, l’acetaldeide, è incanalata direttamente verso il sito
iii
attivo di ADA, proteggendo la cellula dalla sua tossicità. La deidrogenasi ADA richiede come
cofattori NAD+ e CoA per trasformare l’acetaldeide in acetil-CoA. Quest’ultimo e il piruvato,
prodotto da HOA insieme all’acetaldeide, sono i prodotti finali del pathway che verranno
incanalati nel ciclo degli acidi tricarbossilici.
La caratterizzazione funzionale degli enzimi ADA ed HOA coinvolti in questo evento
di channeling enzimatico è iniziata con la costruzione di un sistema eterologo per la
produzione delle proteine ricombinanti in E. coli. Successivamente è stata realizzata la loro
purificazione e lo studio dei loro parametri cinetici. La caratterizzazione delle proteine
ricombinanti e l’analisi delle proprietà catalitiche dell’enzima bifunzionale pheADA-HOA è
importante, insieme alla struttura 3D predetta, per realizzare una fine correlazione strutturafunzione.
Pseudomonas sp. OX1 è capace di crescere utilizzando o-xilene come unica fonte di
carbonio ma non è capace di metabolizzare m- e p-xilene. A partire da questi due isomeri
dello xilene ToMO e PH catalizzano la progressiva ossidazione dell’anello aromatico per dare
3,5- e 3,6-dimetilcatecoli che non vengono metabolizzati dalla C2,3O, risultando tossici per la
cellula. Ciononostante, Pseudomonas sp. OX1 conserva nel suo cromosoma i geni per il
catabolismo di m- e p-xilene omologhi ai geni xyl del plasmide TOL di Pseudomonas putida
mt-2, un ceppo che normalmente utilizza questi composti come substrati di crescita.
In ambienti contaminati dai due isomeri dello xilene sono stati isolati mutanti spontanei
di Pseudomonas sp. OX1 in grado di attaccare tali composti ma non l’o-xilene: il catabolismo
procede mediante il TOL pathway attraverso la progressiva ossidazione del gruppo metilico
che porta a metilcatecoli non letali. Si ritiene che i geni xyl siano stati acquisiti in seguito al
trasferimento di un trasposone catabolico: nel ceppo wild-type tale operone è inattivato da una
sequenza di inserzione impedendo la crescita su m- e p-xilene, mentre nel mutante la
sequenza di inserzione traspone nel locus codificante ToMO bloccando l’utilizzo dell’oxilene.
Nel corso di questo dottorato di ricerca è stato realizzato l’isolamento dei geni xyllikeQK
codificanti l’aldeide deidrogenasi (acetilasi) ADA e l’aldolasi HOA, omologhi ai geni
xyl di Pseudomonas putida mt-2. In seguito è stata affrontata la caratterizzazione funzionale
degli enzimi xyl-like ADA ed HOA a partire dalla costruzione di un sistema eterologo per la
produzione delle proteine ricombinanti in E. coli. Dopo la loro purificazione e lo studio dei
parametri cinetici, la caratterizzazione dell’enzima bifunzionale xyl-like ADA-HOA è
proseguita in uno studio di homology modeling che ha portato alla realizzazione della struttura
3D del complesso enzimatico.
iv
Nei microrganismi, la capacità di attivare o silenziare in maniera estremamente rapida
l’espressione di vie metaboliche differenti è fondamentale per l’adattamento ad un ambiente
mutevole, assicurando la performance non solo della singola cellula, ma anche della
popolazione batterica e perfino della comunità microbica. I promotori batterici possono
processare vari segnali fisico-chimici e metabolici per regolare la loro attività: in particolare
tali segnali sono mediati da specifiche proteine di regolazione. Molti operoni per il
catabolismo dei composti aromatici sono regolati attraverso un circuito s54dipendente. La
RNA polimerasi contenente il fattore alternativo s54 riconosce e lega una classe di promotori
caratterizzata dalla presenza di motivi GG e GC nelle posizioni -24 e -12, rispettivamente.
Elementi definiti enhancer-like o UASs (Upstream Activating Sequences), localizzati a circa
100 o 200 bp a monte delle sequenze -12/-24, sono le regioni a cui si legano le proteine di
regolazione. La s54-RNAP forma complessi chiusi stabili con il promotore ma è incapace di
catalizzare l’isomerizzazione verso il complesso aperto che avvia la trascrizione.
L’isomerizzazione si realizza solo in seguito all’interazione con un attivatore trascrizionale
appartenente alla classe NtrC-like. Questi attivatori presentano tre domini strutturali e
funzionali: il dominio amino-terminale A, che riconosce e lega la molecola aromatica come
effettore; il dominio carbossi-terminale D che lega il DNA, e il dominio centrale C con
attività ATPasica. In assenza dell’effettore, il dominio A agisce come repressore
intramolecolare bloccando il regolatore in una forma inattiva; l’interazione tra il dominio A e
la specifica molecola effettrice rimuove questo blocco, permettendo il passaggio alla forma
attiva capace di interagire con il DNA e la s54-RNAP, promuovendo così la trascrizione.
È noto il meccanismo che regola l’espressione dei geni tou: un regolatore trascrizionale
appartenente alla famiglia degli attivatori NtrC-like, detto TouR, controlla positivamente
l’espressione di ToMO. Pseudomonas sp. OX1 è il primo ceppo che degrada il toluene in cui
un operone codificante una toluene-monoossigenasi (tou operon) è stato trovato associato ad
un operone dmp-like (phe operon). La presenza dell’operone phe e di un regolatore
responsivo a fenolo e metil-fenoli (TouR) nel genoma di Pseudomonas sp. OX1 suggerisce
che, in questo ceppo, la via per il catabolismo di toluene e di o-xilene si sia evoluta in seguito
ad un evento di espansione verticale che ha portato all’incorporazione del cluster genico tou
in una via preesistente per il catabolismo del fenolo. Considerando valida l’ipotesi che il locus
tou sia stato acquisito nel genoma di Pseudomonas sp. OX1 in seguito ad un evento di
espansione di una via catabolica preesistente, si ritiene che anche l’espressione dell’operone
phe sia sotto il controllo di un promotore s54-dipendente e che possa essere regolata
positivamente da TouR o da un attivatore appartenente alla stessa famiglia.
v
Un ulteriore obiettivo della ricerca è l’isolamento e la caratterizzazione della regione
promotrice Pphe. La regione 5’ non tradotta dell’operone phe di Pseudomonas sp. OX1 è stata
isolata e caratterizzata. Successivamente sono stati realizzati un serie di esperimenti che
hanno portato all’isolamento e all’identificazione di un putativo fattore di regolazione
dell’espressione del phe operon.
La capacità mostrata da Pseudomonas sp. OX1 di crescere su diversi substrati
aromatici, insieme alla possibilità di esprimere geni silenti in risposta a cambiamenti delle
condizioni ambientali, conferisce a questo microrganismo una straordinaria versatilità
metabolica che lo rende un candidato ottimale da impiegare nell’ambito del biorisanamento
ambientale.

pathway, leading to intermediate of the tricarboxylic acid cycle.
Many informations are available for ToMO and PH. The two recombinant complexes
were reconstituted and expressed in vitro, demonstrating their enzymatic activity, by the Prof.
Di Donato team from Federico II University in Naples.
The characterization of the lower-meta pathway has not yet been completed. It was
shown that the phe operon has an homologous genetic organization to dmp operon (di-methylphenol
operon) of Pseudomonas sp. CF600. The research group previously mentioned also
expressed, purified and characterized the enzymes involved in the initial reactions of the meta
pathway: the catechol 2,3 dioxygenase (C2,3O), encoded by the pheB gene, the 2-
dehydrogenase (HMSD), encoded by the pheC gene, and the 2- hydroxymuconic
semialdehyde hydrolase (HMSH), encoded by the pheD gene. The C2,3O catalyzes the
extradiolic aromatic ring cleavage reaction of upper pathway catechol derivatives, with
production of 2-hydroxymuconic semialdehyde (HMS). The meta cleavage products are
metabolized by HMSD or by HMSH.
The sequencing of the meta pathway genes, for the phe operon complete
characterization, was completed by the group of Prof. Carla Caruso of the University of
Tuscia in Viterbo. The sequence of pheGFHI genes has been elucidated: they encode the 4-
Hydroxy-2-oxovalerate Aldolase (HOA) and the Aldehyde dehydrogenase (acylating) (ADA)
(pheG and pheF genes), the 4-Oxalocrotonate Decarboxylase (4OD) and the 4-Oxalocrotonate
Isomerase (4OI) (pheH and pheI genes).
An high degree of identity is between the aminoacidic sequences of ADA and HOA
enzymes from P. sp. OX1 and the corresponding DmpF and DmpG enzymes characterized in
P. sp. CF600; moreover, the crystallographic structures of DmpF and DmpG are available on
the PDB (Protein Data Bank) database. Therefore, was performed an homology modeling
study to realize the three-dimensional models of the two proteins for their structural
characterization.
The aims of this thesis are biochemical characterization of lower-meta pathway ADA
and HOA enzymes from Pseudomonas sp. OX1 and the elucidation of the transcriptional
mechanism by which the phe genes expression is regulated.
ADA and HOA are associated in a bifunctional enzyme complex by which the HOA
product, acetaldehyde, is channeled directly into the ADA active site, protecting the cell from
its toxicity. ADA requires NAD + and CoA as cofactors to turn acetaldehyde into acetyl-CoA.
Pyruvate and acetyl-CoA are the final products of the pathway and they will be
channeled into tricarboxylic acid cycle.
viii
The functional characterization of ADA and HOA enzymes involved in this
channelling, begins with the construction of a heterologous system for the production of
recombinant proteins in E. coli and it is continued with the purification and the study of their
kinetic parameters. The characterization of recombinant proteins and the analysis of their
catalytic properties, together with the predicted 3D structure, will to achieve a fine structurefunction
correlation.
Pseudomonas sp. OX1 is able to grow using o-xylene as the sole carbon source but it is
not able to metabolize m-and p-xylene. From these two isomers of xylene, ToMO and PH
catalyze the oxidation of the aromatic ring to give 3,5- and 3,6-dimethylcatechols, that are not
metabolized by C2,3O, resulting toxic to the cell. However, Pseudomonas sp. OX1 retains
genes for the catabolism of m- and p-xylene, omologs to xyl genes of the TOL plasmid of
Pseudomonas putida mt-2, a strain that normally uses these compounds as growth substrates.
In environments contaminated by the two isomers of xylene, spontaneous mutant of
Pseudomonas sp. OX1 able to metabolized these compounds, but not the o-xylene, have been
isolated: the catabolism proceeds through the TOL pathway, through the progressive
oxidation of methyl group that leads to not lethal methylcatechols. It is believed that xyl genes
have been acquired by a catabolic transposons: in wild-type strain that operon is inactivated
by an insertion sequence, preventing the growth on m- and p-xylene; in the mutants, the
insertion sequence transposes in the locus coding ToMO, blocking the use of o-xylene.
During this work, were isolated the genes coding xyl-like enzymes: the Aldehyde
dehydrogenase (acylating) ADA and the Aldolase HOA, corresponding to the xylQK genes
from Pseudomonas putida mt-2. We created an heterologous system for the production of
recombinant proteins in E. coli. After their purification and the study of kinetic parameters,
we characterized Xyl-like ADA-HOA bifunctional enzyme structure by an homology
modeling study to create the 3D structure of the enzyme complex.
In microorganisms, the ability to readily activate or silence the expression of different
metabolic pathways is essential for adapting to a changing environment, ensuring the
performance not only of the single cell, but also of population and even of the microbial
community. Promoters have to process different physicochemical and metabolic signals to
regulate their activities: those signals are mediated by specific regulatory proteins. Many
operons for the catabolism of aromatic compounds are regulated by means of s54-dependent
circuit. The RNA polymerase (RNAP) containing the alternative sigma factor s54 recognizes
and binds a class of promoters, which are characterized by GG and GC motifs at positions -24
and -12, respectively. Enhancer-like elements or UASs (Upstream Activating Sequences),
located about 100 or 200 bp upstream of -12/-24 regions, represent the binding site of
ix
regulatory proteins. The s54-RNAP forms stable closed complexes with the promoter and is
unable to catalyze the isomerization to the open complex initiating transcription. The
isomerization takes place only upon interaction with an NtrC-like transcriptional activator.
These activators have three structural and functional domains: the amino-terminal A domain,
which recognizes and binds effector molecules; the carboxy-terminal D domain that binds the
DNA, and the central C domain with ATPase activity. In the absence of effectors, the A
domain acts as an intramolecular repressor, blocking the regulator in an inactive form; the
interaction between the A domain and the specific effector removes this repression, leading to
the active form, able to interact with DNA and s54-RNAP and promoting transcription.
We know the mechanism that regulates the expression of tou genes: a transcriptional
regulator belonging to the family of activators NtrC-like, TouR, positively controls the
expression of ToMO. Pseudomonas sp. OX1 is the first strain that degrades toluene in which
the toluene-monooxygenase encoding operon (tou operon) has been found associated to a
dmp-like operon (phe operon). The presence of a dmp-like operon (phe operon) together with
a phenol responsive regulator (TouR) suggests that, in this strain, the toluene and o-xylene
catabolic pathway evolved by vertical expansion which led to the incorporation of the tou
gene cluster in a preexisting route for phenol catabolism. This observation suggest that the
phe operon expression is under the control of a σ54-dependent promoter and can be regulated
positively by TouR or another activator belonging to the same family.
A further objective of this research is the isolation and characterization of the Pphe
promoter region. The phe operon 5' non-translated region of Pseudomonas sp. OX1 was
isolated and characterized. Were subsequently made a series of experiments that led to
isolation and identification of a putative regulation factor of the phe operon.
The ability shown by Pseudomonas sp. OX1 to grow on different aromatic substrates
with the ability to express otherwise silent genes in response to changes in environmental
conditions, gives an extraordinary metabolic versatility that makes this strain an ideal
candidate to be used in bioremediation.
Description: 
Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellulare
URI: http://hdl.handle.net/2067/1245
Rights: If not otherwise stated, this document is distributed by the Tuscia University Open Archive under a Creative Commons 2.0 Attribution - Noncommercial - Noderivs License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.0/)
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