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Title: Biodiversità genetica nelle specie Juglans Regia L, Juglas Nigra L e nei relativi ibridi interspecifici
Authors: Pollegioni, Paola
Keywords: SSRS;DNA Fingerprinting;Analisi di parentela;NBS profiling;Antragnosi;AGR/07
Issue Date: 10-Feb-2009
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca 21. ciclo
Abstract: 
Juglans nigra (noce nero) e Juglans regia (noce comune o Persiano) sono specie di grande importanza economica. Il noce comune, originario dell’Eurasia, dai Balcani al Sud ovest della Cina, è coltivato in tutte le regioni temperate del mondo sia per la produzione di legno pregiato sia di frutta secca. Il noce nero, nativo dell’America settentrionale, è una specie a rapida crescita dal legno colore rosso bruno usato nell’industria del mobile ma anche nella produzione dei più svariati oggetti. Entrambe le specie sono monoiche ed eterodicogame, con lo stesso numero di cromosomi. Sebbene l’analisi filogenetica abbia dimostrato che il noce nero ed il noce comune appartengano a due differenti sezioni del genere Juglans, possono tuttavia dare origine ad ibridi interspecifici naturali Juglans x intermedia Carr. (J. nigra x J. regia). Tuttavia l’ibridazione tra noce nero e noce comune non è un processo frequente in natura, sia per la separazione temporale della fioritura tra le due specie parentali sia per alcuni meccanismi d’incompatibilità genetica come l’insuccesso nella fecondazione (fattori pre-zigotici) e la mortalità durante la prima fase di sviluppo dello zigote (fattori post-zigotici). L’identificazione e la selezione di piante “ibridogene” costituisce il primo passo per la produzione di una discendenza ibrida. Pur disponendo di piante ibridogene, risulta ancora particolarmente difficile effettuare incroci controllati. Tuttavia in Francia sono stati allestiti impianti da seme per la produzione di un ibrido noto come NG23 x RA. Questi impianti utilizzano una pianta madre plus J. nigra liberamente impollinata da quattro piante padri plus J. regia che assicurano il necessario apporto di polline. L’identificazione delle piante parentali attraverso osservazione fenologiche e la loro propagazione clonale per innesto ha avuto inizio negli anni 80’ ed ha richiesto più di dieci anni di lavoro. Rispetto alla specie J. regia, la maggior parte degli ibridi J. x intermedia presenta grande vigore, adattabilità a vari terreni, ottima qualità del legno, maggiore resistenza alle gelate primaverili e minore suscettibilità ad alcuni patogeni. Il noce comune è sensibile all’attacco d’insetti, all’asfissia radicale per allagamento e siccità; è suscettibile ad alcune malattie quali batteriosi, antracnosi, e cancro corticale del fusto. In particolare l’antracnosi causata dal fungo Gnomonia leptostyla (Fr.) Ces. è una delle malattie più dannose per la produzione di legname e frutti; può attaccare le foglie, frutti, rami e provocare la formazione di aree necrotiche irregolari spesso circondate da un piccolo alone clorotico. In condizioni particolarmente favorevoli tale malattia può causare la defogliazione precoce, la cascola dei frutti e l’atrofizzazione del seme. La selezione di genotipi resistenti all’antracnosi rappresenta una valida alternativa alle pratiche agronomiche e chimiche (fungicidi). Nel noce nero non è stata ancora individuata una resistenza completa all’antracnosi sebbene esista un ampio range di variabilità; studi indicano che la resistenza naturale alla G. leptostyla è un carattere altamente ereditabile, incoraggiando un possibile miglioramento genetico nel noce. La resistenza ai patogeni nelle piante è spesso basato su un modello gene-for-gene: una proteina codificata da un gene-R interagisce con un ligando avirulento del patogeno, conferendo parziale o totale resistenza alla malattia. I geni Resistant-disease delle piante sono suddivise in quattro principali famiglie e, ma la maggior parte di essi sono membri della famiglia cytoplasmic nucleotide binding site -leucine rich repeat (NBS-LRR)-containing R-gene. La regione NBS, tipica dei geni-R, presenta numerosi motivi altamente conservati come P-loop, kinase -2 ed GLPL. Le proteine NBS sembrano essere coinvolte nei meccanismi di riconoscimento dei patogeni e nell’attivazione delle reazioni a cascata che inducono le risposte fisiologiche di difesa. Il riconoscimento del patogeno mediato dalle proteine codificate dai receptor-like R gene, generalmente causa la risposta d’ipersensibilità, associata all’induzione coordinata di un set integrato di difese quali il rafforzamento della parete cellulare, la produzione extracellulare di specie reattive dell’ossigeno (ROS), l’accumulo di composti fenolici, la sintesi di fitoalexine, la deposizione di papille e l’accumulo di pathogenesis-related proteins. L’effetto dello juglone (5-idrossi-1,4-naftochinone) e del suo precursore l’idrojuglone glucoside è correlato alla parziale resistenza all’antracnosi tipica delle foglie immature nel noce nero. Sebbene non siano ancora noti i meccanismi coinvolti, supponiamo che la resistenza alla G. leptostyla sia da classificare come una “race-specific resistance” dovuta ad una interazione tra il prodotto di un gene-R ed un ligando genico avirulento. Recentemente è stata proposta una nuova strategia per l’amplificazione di una ampia collezione di frammenti di geni-R o -Resistant Analogues (RAG). L’NBS-profiling approach è basato sull’amplificazione mediante PCR del DNA genomico, usando un primer complementare alla sequenza dell’adattatore ed un primer degenerato complementare ad uno dei domini altamente conservati presenti nella regione NBS. In questo modo è possibile ottenere marcatori principalmente localizzati nei geni-R o RAGs. Gli obiettivi del presente studio sono stati (1) Applicazione di dieci loci microsatellitari nucleari per la caratterizzazione genetica di piante J. nigra, J. regia, e di nuovi J. x intermedia in una popolazione mista (Parco di Villa Mezzalira). In particolare tale studio ha permesso di confermare la trasferibilità di dieci loci SSR dal noce nero al noce comune. (2) Selezione a posteriori di piante ibridogene di noce mediante analisi di parentela con marcatori microsatellitari di
famiglie half-sib collezionate nel Parco di Villa Mezzalira. Verificare se questo metodo marker-assistito a breve termine potrebbe rappresentare una strategia alternativa per l’identificazione di nuove combinazioni parentali per la produzione di ibridi. (3) Analisi genetica preliminare di germoplasma Italiano di noce (Azienda Ovile, CRA-ISPIO, Unità di Ricerca Forestale, Roma), usando marcatori molecolari funzionali strettamente associati ai geni Resistant o Resistant Analogs per individuare genotipi resistenti all’antracnosi: applicazione dell’ NBS-profiling approach per la prima volta su specie forestali.
Dieci microsatelliti, testati su una popolazione mista di noce presente nel Parco di Villa Mezzalira, hanno amplificato in entrambe le specie producendo frammenti di dimensioni variabili; otto (7.14 %) sono comuni, 68 (60.7 %) hanno amplificato solo in J. nigra e 36 (32.1 %) solo in J. regia (alleli specie specifici o privati). Gli indici di diversità genetica hanno rivelato elevati livelli di variabilità. L’Analisi delle Coordinate Principali basata su 112 alleli ha diviso il set di campioni totali (138 piante) in tre gruppi principali: J. nigra (82), J. regia (49) e ibridi J. x intermedia hybrids (7). Effettuando l’analisi di fingerprinting mediante SSRs è stata identificata una pianta triploide ibrida (N21), caratterizzata da due terzi del corredo cromosomico J. nigra ed un terzo J. regia. L’analisi citologica ha confermato la natura triploide della pianta N21, visualizzando 48 cromosomi somatici. L’analisi di maternità per esclusione dei sette ibridi diploidi identificati ha indicato una sola possibile madre ibridogena (N17). L’analisi di sequenza dei frammenti amplificati ha confermato la trasferibilità dei dieci loci microsatellitari. Differenze interspecifiche tra alleli non sono dovute solo a variazioni nel numero delle unità ripetute ma anche a mutazioni nelle regioni fiancheggianti il microsatellite.
La stessa serie di primer SSR è stata utilizzata per effettuare l’analisi di DNA fingerprinting e di parentela su 461 individui-figli (otto famiglie half-sib) collezionati nel Parco di Villa Mezzalira. Alti livelli di polimorfismo hanno influenzato positivamente le probabilità d’esclusione e d’identità. L’analisi d’assegnazione ha rivelato la presenza di 198 ibridi diploidi J. x intermedia tra tutte le piantine-figlie (42,9%). Il check di maternità su tutti gli individui campionati ha permesso d’individuare alcuni errori di campionamento (0.06%). Quattro distinte madri ibridogene sono state identificate: come atteso N17 ma anche N23, N24 tra i genotipi J. nigra e la pianta triploide ibrida N21. Le tre piante madri di noce nero hanno mostrato un differente successo riproduttivo. L’analisi di paternità di 198 ibridi diploidi appartenenti a quattro famiglie, ottenute per libera impollinazione, è stata effettuata applicando il most-likelihood approach basato su nove loci microsatellitari. I dati ottenuti dimostrano che vi è un differente successo riproduttivo tra i donatori di polline all’interno del sito di ricerca. Nella produzione di progenie ibrida, il successo riproduttivo maschile non è risultato equamente distribuito ne quantitativamente ne geograficamente. In particolare 49 (47.5%) degli ibridi diploidi identificati sono figli di solo tre piante J. regia. La distanza e l’orientamento tra alberi potrebbe aver influenzato il pattern d’impollinazione ma solo marginalmente. I tempi di rilascio del polline ed eventuali incompatibilità genetiche potrebbe essere alla base di tali risultati. La selezione a posteriori delle piante ibridogene potrebbe essere una valida alternativa ai tradizionali approcci consentendo d’identificare nuove combinazioni parentali a basso costo ed in breve tempo senza disporre di osservazioni morfologiche e fenologiche degli alberi.
Un totale di 132 piante, conservate in Azienda Ovile, sono state analizzate usando marcatori neutrali (SSR) e funzionali (NBS). Tali campioni sono stati comparati con le 597 piante già genotipizzate collezionate nel Parco di Villa Mezzalira. L’analisi microsatellitare di 132 campioni ha confermato la classificazione originale basata su osservazioni morfologiche: l’analisi d’assegnazione ha classificato 63 genotipi come noce comune (J. regiaRA) e 69 come noce nero (J. nigraJN). Inoltre basandoci sulla percentuale di superficie necrosata delle foglie, tali genotipi sono stati ulteriormente suddivisi in tre principali gruppi: (68) J. nigraJN resistenti, (1) J. nigraJN suscettibile, e (63) J. regiaRA suscettibili all’antracnosi. Osservazioni fenologiche indicano che i differenti tassi di emissione delle foglie riscontrati in questo studio (J. nigra e J. regia sono specie dalla ripresa vegetativa rispettivamente tardiva e precoce) potrebbero essere associati con la resistenza all’antracnosi. Tuttavia questa ipotesi non giustifica la presenza di un genotipo J. nigra suscettibile. Un totale di quattro combinazioni NBS-enzima di restrizione (RsaI-NBS1, RsaI-NBS5A6, MseI-NBS1 e MseI-NBS5A6) hanno amplificato nel genere Juglans. Il primer NBS1 ha come target una parte del motivo P-loop mentre il primer NBS5A6 ha come sito bersaglio il motivo Kinase2. Delle 320 bande totali amplificate, 48 sono risultate comuni, 144 J. nigra specifiche e 128 J. regia specifiche. Un’analisi dettagliata della distribuzione dei frammenti ha rivelato la presenza di un possibile marcatore candidato NBS correlato alla resistenza/suscettibilità all’antracnosi nel noce. Nella combinazione NBS1-RsaI, le 64 piante di noce suscettibili, 63 J. regia RA; una J. nigra JN, mostrano una banda comune di 110bp di lunghezza che al contrario è assente nelle 68 piante J. nigra resistenti.

Juglans nigra (Eastern black walnut) and Juglans regia (common or Persian walnut) are highly economically important species. The Persian walnut, an indigenous species in Eurasia from the Balkans to southwest China, is cultivated throughout the temperate regions of the world for its high quality wood and edible nuts. Black walnut, native to the Eastern part of North America, is a fast growing species with a dark-colored wood used in the manufacture of furniture and other wood products. Both species are monoecious and heterodichogamous, with the same number of chromosomes. Although phylogenetic analysis has demonstrated that black walnut and Persian walnut belong to different sections of genus Juglans, a hybrid between them, Juglans x intermedia Carr. (J. nigra x J. regia), can occur naturally. However the hybridization between black and Persian walnut is not common in nature, because of temporal separation between flower maturity of both parent species and some genetic incompatibility mechanisms as failure of fertilization (pre-zygotic factors) and embryo abortion (post-zygotic factors). The identification and selection of “hybridogenic” parents is the first step to obtain hybrid progeny. Although some hybridogenic trees were detected, controlled crosses remained yet unsuccessfully. Nevertheless, seed orchards were established in France generating the so-called NG23 x RA walnut hybrid. These open-pollinated seed orchards involved the deployment of one J. nigra plus tree as female parent and four J. regia plus trees as male parents to ensure enough pollen pressure. The identification of parental plants by phenological observations and their clonal propagation by grafting started in the 1980s and required more than ten years. Compared to the parental species, most J. x intermedia hybrids show increased vegetative vigour, soil adaptability, good wood quality, greater winter-hardiness and less susceptibility towards to pathogenic infection than J. regia. Common walnut is susceptible to the damage caused by pests, flooding, drought and resulted susceptible to some walnut disease as anthracnose, bacteriosis and bark cancer. Particularly the anthracnose caused by Gnomonia leptostyla (Fr.) Ces. is one of the most important diseases of walnut for timber production; symptoms develop on leaves, stem and fruit as irregular necrotic areas that are often surrounded by small chlorotic halos. In severe cases, these lesions may cause premature defoliation , fruit drop or poorly filled nuts. The selection of resistant genotypes toward the anthracnose disease could represent a valid alternative to the cultural and chemical (fungicides) management. In black walnut complete resistance to the anthracnose fungi has not been found although a wide range in susceptibility exists; studies indicated that the natural resistance to G. leptostyla is highly heritable, encouraging genetic breeding programs in walnut. Most resistance to pathogens in plants is based on gene-for-gene model: an R-gene product recognises a pathogen gene product in the host, conferring full or partial resistance. Plant disease (R) genes fall into four mainly families, but the vast majority of them are members of the cytoplasmic nucleotide binding site -leucine rich repeat (NBS-LRR)-containing R-gene family. The NBS region of the characterized R genes contain several highly conserved motifs including P-loop, kinase -2 and GLPL motif. The NBS-LRR proteins seem to be involved in recognizing pathogens and activating signal transduction pathways to induce defences responses. Specific pathogen recognition governed by receptor-like R gene products usually lead to a hypersensitive response, associated with the coordinated induction an integrated set of defence responses as cell wall rigidification, the extracellular generation of reactive oxygen species (ROS), accumulation of phenolic compounds, synthesis of phytoalexins, deposition of papillae and accumulation of pathogenesis-related proteins. The effect of juglone (5-hydroxy-1,4-naphoquinone) and his precursor hydrojuglone glucoside on anthracnose in black walnut were correlated with a partial resistance typical of juvenile leaves. Although the mechanisms underlying such results are still poorly understood, we supposed that the resistance to G. leptostyla has been classified as “race-specific resistant” mediated by an interaction between R-gene product and avirulant pathogen ligand. Recently a new strategy was proposed to amplify a large collection of R-gene and R-gene Analogues (RGA) fragments. The NBS-profiling approach is based on PCR amplification using an adapter primer for an adapter matching a restriction enzyme site and a degenerate primer targeting the conserved domains present in the NBS region. In this way it is possible to obtain DNA profiles with markers mainly present in R-genes and RGAs. The aims of this work consisted of (1) Application of ten microsatellite nuclear markers for the genetic characterization of J. nigra, J. regia, and new J. x intermedia plants in a mixed Italian population (Villa Mezzalira’s Park). In particular, for the first time this research was also designed to confirm the transferability of ten black walnut SSR loci to Persian walnut. (2) Retrospective selection of hybridogenic walnut trees by microsatellite parentage analysis of half-sib families collected in the Villa Mezzalira’s Park. Verify if this short term marker-assisted breeding tactic could represented an alternative way to
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detect new hybridogenic genotypes for walnut hybrid breeding programs. (3) Preliminary genetic analysis of Italian walnut germplasm (Azienda Ovile, CRA-ISPIO, Unità di Ricerca Forestale, Rome) using functional molecular markers tightly linked to R-gene and RGAs to detect genotypes resistant to anthracnose: application for the first time of NBS-profiling approach on forest species.
Ten microsatellites tested in the mixed walnut population collected in Villa Mezzalira’s Park amplified in both species, producing fragments of variable size; eight (7.14 %) were common, 68 (60.7 %) amplified in J. nigra and 36 (32.1 %) in J. regia only (private alleles). Indices of genetic diversity revealed high level of variability. The Principal Coordinate Analysis on the basis of total 112 alleles divided the total sample set (138 plants) into three main groups: J. nigra (82), J. regia (49) and J. x intermedia hybrids (7). Performing the microsatellite fingerprinting, a triploid hybrid plant with two genome parts of J. nigra and one part of J. regia was identified (N21). The cytological analysis proved this triploid state showing 48 somatic chromosomes. The mother testing analysis of the 7 diploid hybrids by exclusion method indicated one putative hybridogenic mother plant (N17). The sequence analysis of amplified fragments confirmed the cross-species amplification of SSR. Inter-specific differences between alleles were due not only to simple changes in the number of repeats but also to mutations in the flanking regions.
The same battery of 10 SSR primer pairs was used to perform the DNA fingerprinting and parentage tests of 461 progeny individuals (eight half-sib families) collected in the Villa Mezzalira’s Park. The high levels of polymorphism detected positively influenced the exclusion and identity probabilities. The assignment analysis revealed the presence of 198 diploid J. x intermedia hybrids among the total of the progeny seedlings (42.9%). Maternity checks were carried on all individuals and few errors of sampling (0.06 %) were found. Four distinct hybridogenic mother trees were identified: as expected N17 but also N23, N24 J. nigra genotypes and the triploid hybrid plant N21. These three black walnut plants showed a different reproductive success rates. Paternity of 198 diploid hybrids detected in four open-pollinated families were inferred by using the most-likelihood approach based on nine microsatellite loci. Differential male reproductive success was observed among pollen donors within the research site. In the production of hybrid progeny the male reproductive success was unevenly distributed both in amount and in space. In particular 49 (47.5 %) of the total diploid hybrids detected in four half-sib families were sired by only three J. regia genotypes. Distance and orientation between trees may influence pollination, but it is probably not a major determinant of pollen success. The timing of pollen release and genetic incompatibilities could be a plausible explanations for the observed fertilization pattern. This retrospective selection may represent an alternative measure to the traditional approach offering a method to identify new parental combinations at a reasonable cost, with no phonological and morphological data available of the trees.
A total of 132 Juglans plants, conserved in Azienda Ovile, were sampled and analyzed using neutral (SSRs) and functional markers (NBS). This germplasm was compared to 597 plants located in the Villa Mezzalira’s Park and already genotyped. Microsatellite fingerprinting analysis of 132 samples confirmed the former classification based on morphological observations; the assignment analysis classified 63 genotypes as common walnut (J. regiaRA) and 69 samples as black walnut (J. nigraJN). In addition according to the percentage of leaf necrosis area these genotypes were further divided in three main group: (68) J. nigraJN resistant, (1) J. nigraJN susceptible, and (63) J. regiaRA susceptible to anthracnose. Phenological observations indicated that the different leaf emergence rates noted in this study (J. nigra and J. regia was late and early emerging species respectively) could have some association with resistance to anthracnose. Nevertheless this hypothesis didn’t justified the presence of a susceptible genotype J. nigra. A total of 4 primer NBS-enzyme combinations (RsaI-NBS1, RsaI-NBS5A6, MseI-NBS1 and MseI-NBS5A6) amplified in Juglans spp. These primers were designed from a part of the conserved P-loop motif for NBS1 and of kinase-2 for NBS5A6. Out of the total (320 bands), 48 fragments were common, 144 fragments amplifying in J. nigra and 128 in J. regia only. A deeply analysis of NBS marker distributions revealed the presence of a putative candidate R-gene linked marker correlated to resistance/susceptibility to anthracnose in walnut. In the NBS1-RsaI combination, all susceptible plants, 63 J.regiaRA and one J. nigraJN, showed a common band of 110 bp in length which was not present on the 68 resistant J.nigraJN plants.
Description: 
Dottorato di ricerca in Ecologia forestale
URI: http://hdl.handle.net/2067/1195
Rights: If not otherwise stated, this document is distributed by the Tuscia University Open Archive under a Creative Commons 2.0 Attribution - Noncommercial - Noderivs License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.0/)
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