Regolazione dell’oncogene Myc nel differenziamento della linea Caco-2

Abstract

La linea cellulare di adenocarcinoma del colon Caco-2, se coltivata a confluenza, differenzia spontaneamente verso un fenotipo intestinale. Poco è noto riguardo ai meccanismi che regolano il processo differenziativo di queste cellule che mostrano mutazioni inattivanti a livello delle proteine APC e β-catenina. Queste mutazioni sono solitamente associate ad una stimolazione costitutiva di geni regolativi del ciclo cellulare quali Myc e la ciclina D1. Nonostante ciò, le Caco-2 sono in grado di uscire dal ciclo cellulare e mostrano un controllo trascrizionale e traduzionale, regolato nel tempo, di geni specifici del differenziamento intestinale. Attraverso lo studio dell’espressione e modulazione di RNA e di proteine nel processo differenziativo abbiamo notato che le proteine Myc e ciclina D1, entrambe bersaglio trascrizionale del complesso β-catenina/TCF, sono regolate in maniera differente. Abbiamo quindi deciso di indagare il ruolo della regolazione di Myc nel differenziamento delle Caco-2. In questo lavoro si dimostra che, per il processo differenziativo di questa linea cellulare, è necessaria la completa inibizione di Myc che viene attuata parzialmente a livello trascrizionale, e completamente al livello post-traduzionale. Questa regolazione consiste nel controllo attivo della degradazione di Myc e necessita dell’attività della chinasi GSK3β che fosforila il residuo T58 di Myc in maniera indipendentemente dal ciclo cellulare. Il nostro studio mostra inoltre che l’espressione di Myc in queste cellule è reversibile. Infatti le cellule Caco-2 differenziate, quando ferite con una pipetta pasteur in un saggio Wound Healing, si sono dimostrate in grado di de-differenziare nel giro di poche ore, riprendere l’attività proliferativa ed esprimere nuovamente la proteina Myc

The Caco-2 colon adenocarcinoma cell line spontaneously differentiates to a small intestine phenotype after confluency. Little is known about the mechanisms that regulate the differentiation process in this cell line bearing mutations on APC and β- catenin. These mutations are usually associated with a constitutive upregulation of cellcycle- related regulative genes as Myc or cyclin D1. Despite that, these cells are able to exit from cell cycle after confluency and show an ordered transcriptional regulation of specific genes. By the analysis at the RNA and protein level, we found that the β-catenin- TCF transcriptional targets Myc and cyclin D1 are regulated differently during the differentiation process. In particular we investigated the role of Myc regulation in Caco-2 differentiation. In this work we show that a Myc complete downregulation is necessary for the Caco-2 cells differentiation process and this is achieved through both a transcriptional and a post translational regulation of the protein. The post-translational regulation is based on the regulation of Myc degradation and requires the activity of the GSK3β kinase on the Myc residue T58 in a cell cycle independent mechanism. In addition, differentiated Caco-2 cells, upon wound of the monolayer, are able to de-differentiate , proliferate again and show a renewed expression of Myc protein.