Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/1139
Title: Il ruolo della metilazione dell'istone H3 durante la formazione dell'eterocromatina facoltativa
Authors: Pasqualini, Barbara
Keywords: Su(var)3-9;Eterocromatina facoltativa;Modificazioni istoniche;Epigenetica;BIO/18
Issue Date: 20-Feb-2009
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 21. ciclo
Abstract: 
 Le code istoniche N-terminali protrudono dal nucleosoma e sono soggette a modificazioni posttraduzionali, quali acetilazione, metilazione, fosforilazione, ubiquitinazione e ADPribosilazione. Durante gli ultimi anni sono stati identificati molti enzimi che modificano gli istoni e diverse proteine associate alla cromatina, che si legano in maniera specifica a queste modificazioni. Particolari pattern di modificazioni istoniche sono stati associati a stati distinti della cromatina e sembrano rappresentare un meccanismo capace di estendere il potenziale informativo del codice genetico.
Negli eucarioti, la metilazione della lisina 9 dell'istone H3 (K9H3m3) controlla il silenziamento genico e assolve un ruolo centrale nella formazione dell'eterocromatina costitutiva. La metilazione selettiva della K9 H3 avviene ad opera di una specifica metiltransferasi istonica (HMTase) codificata dal gene Su(var)3-9. Il chromo dominio di HPl, una proteina dell'eterocromatina, si lega alla lisina 9 metilata dell'istone H3 per propagare lo stato eterocromatico. Un'altra modificazione istonica presente sull'eterocromatina pericentromerica è la trimetilazione della K20 H4. La K9H3m3 e la K20H4m3 sembrano, quindi, essere componenti importanti del pathway coinvolto nella formazione dell'eterocromatina pericentromerica.
Il possibile ruolo della proteina SU(VAR)3-9 nell' instaurazione dell' eterocromatina facoltativa resta da chiarire.
Il sistema cromosomico dei Coccidi fornisce un eccezionale esempio di eterocromatizzazione facoltativa, rappresentando quindi un sistema modello ideale per studiare tale fenomeno. Negli embrioni maschili dei Coccidi, l'intero assetto cromosomico aploide di origine paterna diventa eterocromatico allo stadio di blastula, mentre negli embrioni femminili sia il complemento paterno sia il materno restano eucromatici durante lo sviluppo. Nel Coccide Planococcus citri, abbiamo precedentemente identificato PCHET2, una proteina HPI-like che è preferenzialmente associata con l'eterocromatina facoltativa maschio-specifica.
In questo lavoro di tesi mi sono occupata di caratterizzare il ruolo dell'ortologo di Su(var)39 nel Coccidi. A questo scopo, ho identificato e clonato la HMTase Su(var)3-9-like tramite amplificazione per PCR del DNA genomico. La sequenza nucleotidica ottenuta presenta un elevato grado di identità (98%) con la sequenza omologa di Drosophila melanogaster.
Ho allestito esperimenti di RNAi con il dsRNA del set-dominio e ho verificato che l'inibizione dell'espressione della HMTase K9 H3 negli embrioni porta a quasi totale assenza di immunocolorazione con l'anticorpo contro la K9H3m3, in concomitanza con la perdita di segnale per PCHET2 (HPl-like), per la K9H3m2, per la K20H4m3, e la comparsa di morfologie citologiche anomale dell'eterocromatina e dei cromosomi, che avevo già osservato abolendo l'espressione di pchet2 negli embrioni trattati con RNAi. Questi dati suggeriscono, quindi, che il pathway K9H3m3/HPlIK20H4m3 sia coinvolto nell'eterocromatizzazione facoltativa dei Coccidi. Inoltre, l'analisi della mitosi ha evidenziato difetti nella segregazione cromosomica.
Ho anche attuato un diverso approccio per caratterizzare Su(var)3-9 a livello funzionale, impiegando la chaetocina, un metabolica fungino scoperto come il primo inibitore della metiltransferasi istonica specifica della lisina. La chaetocina è specifica per la metiltransferasi SU(VAR)3-9 sia in vitro sia in vivo, e può quindi essere usata per studiare la repressione genica mediata dall'eterocromatina.Gli embrioni trattati hanno mostrato quasi totale assenza d'immunocolorazione con l'anticorpo contro la K9H3m3, in concomitanza con la perdita di segnale per PCHET2 (HPI-like), per la K9H3m2, per la K20H4m3, e la comparsa di morfologie citologiche anomale dell'eterocromatina c dei cromosomi, che avevo già osservato abolendo l'espressione di Su(var)3-9-like negli embrioni trattati con RNAi. Le implicazioni di questi risultati saranno discusse.

The N-termini histone tails protrude from the nucleosome and are subject to posttranslational modifications, including acetylation, methylation, phosphorylation, ubiquitination, and ADPribosylation. During recent years, many histone modifying enzymes and severaI chromatinassociated proteins that specifically bind to these modifications have been identified. Particular histone modification patterns have been associated with distinct chromatin states and are proposed to represent an indexing mechanism that could extend the information potential of the genetic code.
In eukaryotes, histone H3 lysine 9 tri-methylation (K9H3m3) controls gene silencing and plays a central role for the establishment of constitutive heterochromatin. Histone H3 is selectively methylated at lysine 9 by a specific histone methyltransferase (HMTase) codified by Su(var)3-9 gene. The heterochromatin protein HPl binds by its chromodomain to methylated Iysine 9 of histone H3 to propagate the heterochromatic state. H4 trimethylation at Iysine 20 (K20H4m3) is also enriched at pericentric heterochromatin. K9H3 and K20H4 trimethylation seems to be important components of a repressive pathway that can index pericentric heterochromatin.
The possible role of the K9H3 trimethylation by SU(VAR)3-9 in the establishment of facultative heterochromatin has been poorly studied.
The chromosome system of mealybugs provides a dramatic example of facultative heterochromatinization, thus rcpresenting an ideaI model system to investigate such a phenomenon. In male mealybug embryos, the entire paternally-derived, haploid chromosome set becomes heterochromatic at mid-c1eavage, while in female embryos both the paternal plus the maternal complements remain euchromatic throughout ontogeny. In the mealybug Planococcus cifri, PCHET2, an HPl-like protein which is prcferentially associated with the male-specific facultative heterochromatin was previously identified.
In this work explored the role of a Su(var)3-9 ortholog in mealybugs. To this alm, I identified and cloned the Su(var)3-9-like HMTase by PCR amplification from genomic DNA. The nucleotide sequcnce obtained has an high degree of identity (98%) with Drosophila melanogaster's homolog sequence.
I made RNAi experiments with Su(var)3-9-like dsRNA and I showed that the quenching of K9H3-specific HMTase exprcssion in embryos leads to loss K9H3m3 staining concomitant with a loss of staining for PCHET2 (HPI-like), for K9H3m2, for K20H4m3, and the generation of abnormal cytological morphologies of chromatin and chromosomes which are very similar to those observed extinguishing pchet.? expression in embryos by RNAi. Then these data suggest us that the K9H3m3IHPlIK20H4m3 pathway is involved in facultative heterochromatinisation in mealybugs.
I aIso approached to this functional characterization of Su(var)3-9 using the chaetocin, a fungai metabolite discovered as the first inhibitor of a Iysine-specific histone methyltransferase. Chaetocin is spccific for thc methyItransferase SU(VAR)3-9 both in vitro and in vivo and may therefore be uscd to study hcterochromatin-mediated gene repression. Treated embryos showed a Ioss of K9H3m3 staining concomitant with a Ioss of staining for PCHET2, for K9H3m2, for K20H4m3, and the generation of abnormai cytoiogicai morphoIogies of heterochromatin and chromosomes, as I have aIreacly observed extinguishing Su(var)3-9-like expression in embryos by RNAi. The implications of these results wiIl be discussed.
Description: 
Dottorato di ricerca in genetica e biologia cellulare
URI: http://hdl.handle.net/2067/1139
Rights: If not otherwise stated, this document is distributed by the Tuscia University Open Archive under a Creative Commons 2.0 Attribution - Noncommercial - Noderivs License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.0/)
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