Ruolo funzionale della ciclina D3 nel differenziamento miogenico

Abstract

Il differenziamento miogenico è caratterizzato da una sequenza ordinata di eventi; l’uscita irreversibile dal ciclo cellulare, l’espressione di geni muscolo-specifici e la fusione dei mioblasti post-mitotici in miotubi multinucleati. Questo processo è regolato dalla famiglia di fattori trascrizionali miogenici (MRFs) con dominio basico basico “helix-loop-helix”, che comprende MyoD, Myf5, miogenina e MRF4. I segnali mitogeni ostacolano attraverso molteplici meccanismi l’attività dei fattori MRFs, causando l’inibizione dell’espressione dei geni specifici del differenziamento nei mioblasti proliferanti. Al contrario, l’uscita irreversibile dal ciclo cellulare indirizza i mioblasti verso un destino miogenico. In studi precedenti il nostro laboratorio ha dimostrato che MyoD accoppia l’inizio del differenziamento e l’arresto del ciclo cellulare inducendo l’espressione di alcuni geni regolatori del ciclo cellulare: il gene oncosoppresore retinoblastoma, l’inibitore delle chinasi ciclina-dipendenti p21 e la ciclina D3. Mentre per le proteine retinoblastoma (pRb) e p21 è stato dimostrato un ruolo funzionale nell’induzione e nel mantenimento dello stato differenziato, il ruolo della ciclina D3 è ancora ignoto. È stato inoltre dimostrato che nei miotubi terminalmente differenziati la ciclina D3 è altamente espressa e si trova completamente associata a pRb, mentre cellule miogeniche prive di pRb esprimono livelli molto bassi di ciclina D3. Questa osservazione ci ha suggerito che pRb promuove la stabilizzazione della ciclina D3. Nei miei studi ho dimostrato che, nei mioblasti proliferanti, la ciclina D3 mostra un rapido turnover, evento regolato dalla fosforilazione della ciclina D3 da parte della chinasi GSK-3β su una specifico residuo di treonina (Thr-283). La formazione del complesso ciclina D3-pRb nei miotubi terminalmente differenziati impedisce l’accesso della GSK-3β alla ciclina D3, prevenendone così la fosforilazione e la successiva degradazione. I miei risultati indicano che l’espressione ectopica del mutante della ciclina D3(T283A), non fosforilabile e quindi stabile, incrementa il numero di cellule che vanno incontro a differenziamento causando un ritardo temporale dell’espressione genica muscolo-specifica, essendo tuttavia compatibile con il loro differenziamento terminale. Al contrario, l’espressione del doppio mutante stabile ciclina D3-mLXCXE(dl250-272), incapace di legare pRb, causa una riduzione della proliferazione e un differenziamento precoce dei mioblasti C2. Inoltre, l’espressione esogena di MyoD in fibroblasti embrionali murini (MEFs) isolati da topi privi di ciclina D3 induce un fenotipo miogenico defettivo. Questi risultati indicano che l’accumulo pRb-dipendente della ciclina D3 svolge un ruolo necessario durante il processo di differenziamento delle cellule scheletriche muscolari.

The differentiation of skeletal muscle cells is characterized by a coordinated sequence of events that include irreversible exit from the cell cycle, the timely, ordered activation of muscle-specific gene expression, and the fusion of post mitotic myoblasts into multinucleated myotubes. This process is regulated by the basic helix-loop-helix family of myogenic factors (MRFs), which include MyoD, Myf5, myogenin and MRF4. Mitogenic signaling antagonizes by multiple mechanisms the activity of MRFs, which results in the absence of differentiation-specific gene expression in proliferating myoblasts. Conversely, the irreversible withdrawal of myoblasts from the cell cycle promotes their commitment into differentiation. In earlier studies our laboratory has demonstrated that MyoD couples the onset of differentiation with cell-cycle arrest by inducing the expression of critical cell-cycle regulators, including retinoblastoma, the cyclin-dependent kinase inhibitor p21 and cyclin D3. In contrast to retinoblastoma protein (pRb) and p21, little is known about the function of cyclin D3 in the differentiation process. Our laboratory has previously shown that cyclin D3 is highly expressed and nearly totally associated with hypophosphorylated pRb in differentiated myotubes, whereas Rb-/- myocytes fail to accumulate the cyclin D3 protein, suggesting that pRb promotes cyclin D3 stabilization in differentiating myoblasts. In my study I have shown that, in proliferating C2 myoblasts, cyclin D3 displays rapid turnover, which is positively regulated trough glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β)-mediated phosphorylation of cyclin D3 on Thr-283. The pRb-cyclin D3 complex formation in terminally differentiated myotubes hinders the access of GSK-3β to cyclin D3, thus inhibiting Thr-283 phosphorylation and the ensuing degradation of cyclin D3. My results indicate that the ectopic expression of a stabilized cyclin D3(T283A) mutant in C2 myoblasts increases the number of cells progressing toward differentiation by temporarily delaying muscle-specific gene expression, being anyway compatible with their terminal differentiation. Conversely, the expression of a stabilized double mutant cyclin D3-mLXCXE(dl250-272), unable to bind pRb, causes reduced proliferation and precocious differentiation of C2 myoblasts. Furthermore, cyclin D3-null embryonic fibroblasts display impaired MyoD-induced myogenic differentiation. These results indicate that the pRb-dependent accumulation of cyclin D3 is functionally relevant to the process of skeletal muscle cell differentiation.