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Title: Struttura e funzione delle comunità microbiche in suoli contaminati: effetto degli interventi di micorisanamento
Other Titles: Structure and Function of the microbial communities in polluted soils: effect of mycoremediation
Authors: Giubilei, Maria Angela
Keywords: Biorisanamento;Funghi white-rot;Agenti mobilizzanti;Struttura di popolazioni microbiche;DGGE;Real-time;BIO/19
Issue Date: 8-Jan-2009
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 21. ciclo
Abstract: 
La diffusa contaminazione di ecosistemi terrestri e acquatici dovuta all’immissione
di composti di origine antropica ad elevata persistenza è un problema che sta assumendo
una rilevanza sempre maggiore. Date le quantità prodotte e i potenziali effetti negativi
sull’ambiente e sulla salute umana il gruppo di composti più importante è quello dei
cosiddetti “xenobiotici”, molecole di sintesi ad elevata persistenza ed estranee ai
processi biologici.
Le tecnologie che, sfruttando la capacità dei microrganismi, batteri, alghe o funghi,
di degradare i contaminanti, sono in grado di accelerare i fenomeni naturali di
detossificazione dell’ambiente stanno attirando sempre maggiore attenzione (Šašek et
al., 2003). In questo senso, i funghi Basidiomiceti appartenenti al gruppo dei white-rot
sembrano i più interessanti. Nel biorisanamento è anche fondamentale il ruolo della
microflora endogena e fondamentali appaiono le eventuali interazioni con le specie
esogene usate per il bioarrichimento.
Negli ultimi venti anni, è profondamente cambiato l’approccio metodologico allo
studio delle comunità microbiche naturali: sempre più frequente, infatti, è l’utilizzo di
metodi indipendenti dalla coltivazione al fine di superare il problema della non
coltivabilità della maggior parte dei batteri ambientali. Tranne che nella diretta
ibridazione del DNA con sonde specifiche, la maggior parte di tali metodi
(DGGE/TGGE, ARDRA, RFLP/T-RFLP, RISA/ARISA, qRT-PCR) si basano
sulla’analisi di marcatori genetici amplificati con primers “universali” a partire dal
metagenoma estratto direttamente da campioni di suolo, acqua o sedimenti.
Il target maggiormente impiegato nello studio della diversità microbica è il gene
codificante l’rRNA 16S, ma anche molti geni funzionali sono base per lo studio di subpopolazioni
con capacità metaboliche e fisiologiche specifiche (amoA, rpoB, PmoA,
nifH).
I principali obiettivi della presente tesi di dottorato sono stati lo studio della
dinamica della struttura e funzione delle comunità microbiche autoctone in seguito a
processi di micorisanamento su scala di laboratorio condotti su due suoli storicamente
contaminati, uno da idrocarburi aromatici e l’altro da PCB, ed un suolo modello
contaminato “ad hoc” in laboratorio con una miscela di IPA.
Sul suolo modello, contaminato in laboratorio con una miscela di ognuno (50 μg/g)
dei seguenti di IPA: fenatrene, antracene, fluorantene, pirene, crisene,
benzo[k]fluorantene e benzo[a]pirene, è stato valutato l’effetto combinato di agenti
II
mobilizzanti (AM) e micorisanamento (Irpex lacteus 617/93, Pleurotus ostreatus 3004,
Allescheriella sp. DABAC 1 e Phlebia sp. DABAC 9) sulla struttura delle comunità
batteriche indigene. Con Allescheriella sp. e Phlebia sp. sono stati utilizzati gli AM
Tween20 (TW20), Tween 80 (TW80) e olio di soia (OS). Con I. lacteus e P. ostreatus
sono stati usati come AM anche RAMEB (β-ciclodestrine metilate) ed acque di
vegetazione delle olive (AV).
Con Phlebia sp., l’unico AM in grado di provocare un aumento significativo della
deplezione degli IPA, espressa come peso totale dei contaminati residui (TWOC: Tatal
Weight of Organic Contaminants), e valutata sia nei controlli di incubazione che nei
suoli sottoposti a micorisanamento dopo 45 giorni di incubazione, era l’OS. Con
Allescheriella sp., invece, le migliori performance degradative si ottenevano, nel suolo
trattato con TW20 ove si raggiungeva una diminuzione del TWOC pari al 21,6%
rispetto al biotrattamento fungino senza aggiunta di AM.
La detossificazione dei suoli è stati valutata quantificando l’attività deidrogenasica;
Phlebia sp. induceva un livello significativo di detossificazione solo in presenza di
TW80, mentre nel caso di Allescheriella sp. il livello più elevato era raggiunto quando
non erano presenti AM.
La microflora batterica coltivabile endogena era diversamente influenzata con
effetto negativo di OS e TW80 sia nel controllo di incubazione che nel suolo inoculato
con Phlebia sp. mentre con Allescheriella sp. non si osservavano differenze
significative in nessuno dei campioni, indipendentemente dall’AM impiegato. In ogni
caso, era evidente un generale effetto positivo esercitato dai funghi sullo sviluppo della
microflora residente coltivabile.
L’analisi DGGE dimostrava che nel controllo di incubazione in assenza di AM,
entrambi gli indici di biodiversità stimati, richness e Shannon-Weaver, non differivano
significativamente dagli stessi nel suolo pristino. Entrambi questi parametri risultavano
comunque aumentati nei controlli di incubazione trattati con gli AM e i valori più
elevati erano osservabili nei suoli sottoposti a micorisanamento.
In base alla cluster analysis, infine, era evidente come i funghi esercitavano
un’influenza decisiva sulla similarità tra le specie batteriche. Tra gli AM impiegati, il
maggior impatto era dovuto a TW20 e TW80.
Con I. lacteus e P. ostreatus era riscontrabile un’azione diversa degli AM sulle
performance degradative: l’OS risultava il migliore ma un effetto positivo sulle
potenzialità degradative di I. lacteus e P. ostreatus era esercitato, rispettivamente, anche
da TW20 e TW80.
III
Anche in questo caso, l’OS esercitava il maggior effetto negativo sullo sviluppo
della microflora residente, dimostrato anche mediante analisi DGGE: più bassi indici di
biodiversità si riscontravano, infatti, nel controllo di incubazione e nel suolo con I.
lacteus in presenza di tale surfactante.
L’analisi DGGE mostrava, inoltre, che la biodiversità, con P. ostreatus, non
aumentava ma era influenzata dal tipo di AM utilizzato. La cluster analysis indicava
come l’inoculo del suolo con P. ostreatus esercitava la maggiore influenza sulla
similarità tra le popolazioni batteriche; con I. lacteus, invece, il maggior effetto era
esercitato dai surfactanti.
Il sequenziamento di alcuni cloni, corrispondenti a particolari bande DGGE,
mostrava la presenza di specie batteriche, note per le loro capacità di degradare IPA,
appartenenti a generi come Bacillus e Burkholderia.
P. pulmonarius CBS 664.97 e B. rhodina DABAC P82 sono stati testati su suolo
storicamente contaminato sia come tale che fumigato con cloroformio per valutare il
contributo della microflora endogena sull’intero processo. Inaspettatamente, B. rhodina
colonizzava meglio il non fumigato mentre era vero il contrario con P. pulmonarius. Le
performance degradative di entrambi i funghi erano nettamente superiori nei suoli non
fumigati rispetto ai fumigati.
Per valutare l’effetto del micorisanamento sulla microflora endogena sono state
anche effettuate conte dei batteri eterotrofi totali ed analisi DGGE del gene dell’rRNA
16S. Il numero degli eterotrofi totali era superiore nei suoli non fumigati rispetto ai
fumigati, soprattutto biotrattati. L’analisi DGGE evidenziava minore biodiversità nel
suolo come tale (t0 – tf), rispetto al controllo e ai suoli sottoposti ai trattamenti fungini. I
due ceppi sembravano, quindi, aver avuto un significativo effetto sulla struttura della
comunità batterica: le specie stimolate a crescere appartenevano infatti a generi noti per
l’abilità di degradare idrocarburi aromatici.
Un’ulteriore prova di micorisanamento del suolo ACNA è stata condotta con P.
tigrinus con prelievi all’inizio della prova (t0) e dopo 7, 15, 30, 60 giorni (t7, t15, t30,t60)
di incubazione.
Sia da ispezione visiva che da dosaggio dell’ergosterolo (743 μg/g suolo dopo 60
giorni di incubazione) si rilevava veloce colonizzazione del suolo ammendato con la
paglia di mais; venivano, inoltre prodotte Laccasi e Mn-perossidasi (6,54 U/g e 182
mU/g suolo, rispettivamente, dopo 30 giorni di incubazione).
L’analisi GC-MS del suolo trattato con P. tigrinus mostrava abbattimento di molti
dei contaminanti prioritari presenti nel suolo quali: naftalene (57,3%), 1,2,3,4-
IV
tetraclorobenzene (73,5%), 2,4- e 2,6-dicloroaniline (100 e 82.8%, rispettivamente) e
difeniletere (78%). Conte vitali e analisi DGGE mostravano che, nel tempo, si aveva sia
aumento del numero dei batteri eterotrofi totali, che incremento della biodiversità.
Gli indici di biodiversità subivano infatti un aumento, nel caso del controllo di
incubazione, ed in modo più evidente nel suolo biotrattato con il fungo, già dopo 7-15
giorni di incubazione. L’effetto del trattamento fungino, sulla diversità delle
popolazioni batteriche, come emerso dalla cluster analysis era invece riscontrabile dopo
30 giorni di incubazione: si ottenevano infatti due sotto-cluster separati che
comprendevano, uno i controlli di incubazione t30 e t60 e l’altro i suoli biotrattati con P.
tigrinus t30 e t60.
Infine, per valutare se vi fossero effetti, in seguito al micorisanamento, anche su
alcune funzioni metaboliche espletate dalle popolazioni batteriche, sono state effettuate
real-time PCR sui geni codificanti enzimi chiave (naftalene-diossigenasi e catecolo 2,3-
diossigenasi) nella degradazione di alcuni IPA al fine di stimare le variazioni nel
numero di copie dei geni stessi. Sia nel caso del gene nahAc che del gene C230 si
assisteva ad una diminuzione del numero di copie dei geni stessi in seguito al
trattamento fungino.
P. tigrinus e OS sono stati infine impiegati in un suolo storicamente contaminato da
PCB monitorandone nel tempo gli effetti con prelievi all’inizio della prova (t0) e dopo
30 e 60 giorni di incubazione (t30 e t60).
Nei suoli biotrattati la crescita fungina era visibile microscopicamente;
quantificando l’ergosterolo, veniva rilevata, seppur in esigue quantità, anche nei
controlli di incubazione, indicando quindi crescita di specie fungine autoctone.
Nei suoli sottoposti a micorisanamento erano inoltre riscontrabili sia attività
enzimatiche idrolasiche che ossidasiche. Le prime raggiungevano i livelli più elevati
dopo 30 giorni soprattutto in assenza di OS. L’andamento delle attività ossidasiche era
sostanzialmente simile alle idrolasi, ma in questo caso l’OS mostrava pesante influenza
negativa sulla laccasi e positiva sulla perossidasi Mn-dipendente.
Dall’analisi dei dati relativi alle percentuali di deplezione dei congeneri di PCB
estratti dai campioni derivati dalle diverse tesi dopo 60 giorni di incubazione e
quantificati attraverso GC-MS, erano evidenti differenti tipi di effetti dovuti all’azione
della microflora indigena e del fungo esogeno oppure all’aggiunta di OS o stocchi di
mais. L’effetto positivo della microflora residente era evidenziato dalla deplezione dei
diversi congeneri nei microcosmi; emergeva tuttavia un effetto negativo esercitato
dall’OS. Simile effetto sembrava esercitato anche dagli stocchi di mais sulla deplezione
V
dei PCB da parte delle comunità microbiche autoctone. Infine, l’effetto del fungo,
valutato confrontando il controllo d’incubazione ed il suolo bistrattato (con e senza OS),
risultava trascurabile.
L’impatto del micorisanamento sulla composizione delle popolazioni batteriche
autoctone è stato valutato con conte vitali e analisi DGGE. Inoltre, vista la presenza di
funghi autoctoni l’analisi è stata condotta anche sui prodotti di amplificazione del gene
codificante il 18S rRNA eucariotico.
Attraverso le conte si è osservato un graduale aumento del numero di batteri durante
i 60 giorni di incubazione: i maggiori livelli di crescita si avevano nei campioni trattati
con fungo e OS dimostrandosi così un loro effetto positivo sulla componente coltivabile
della microflora endogena.
Dalle analisi DGGE dei geni 16S e 18S rDNA si è evidenziato come sia il
biotrattamento che l’uso di OS avevano effetto significativo sulla biodiversità sia dei
batteri che dei funghi autoctoni, anche non coltivabili.
In base ad analisi qRT-PCR dei geni C230 e bph codificante la bifenil-diossigenasi,
enzima chiave dell’upper pathway della degradazione aerobica dei PCB, non si
osservavano differenze notevoli nel numero di copie; ciò farebbe supporre che a livello
funzionale, il fungo non abbia avuto effetti rilevanti sulle popolazioni batteriche
coinvolte nella degradazione degli inquinanti presenti.
In conclusione, sia la concentrazione che la biodiversità delle popolazioni batteriche
endogene mostrano incrementi in seguito ai processi di micorisanamento ad eccezione
dei casi in cui si utilizza OS con Phlebia sp. e, indipendentemente dall’AM impiegato,
con P. ostreatus. Tutti i funghi utilizzati risultavano efficaci nella decontaminazione e
nella detossificazione dei suoli trattati tranne nel caso di P. tigrinus utilizzato su suolo
storicamente contaminato da PCB. Le attività degradative batteriche si mostravano
coerenti con i risultati di decontaminazione: se il fungo provocava una diminuzione dei
livelli di contaminazione, anche i geni catabolici batterici ne erano influenzati, se il
fungo non aveva effetti, anche i livelli dei geni catabolici batterici non subivano
cambiamenti durante il trattamento.

In the recent years, several polluting compounds have been released into the
environment because of industrial and agricultural activities and represent a threat to
humans and other living organisms. These contaminants are either natural compounds
that have been mobilized to a bioavailable form that is toxic to organisms, such as
polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) present in fossil fuels and heavy metals
present in minerals, or compounds of industrial origin that present chemical structures
alien to the biosphere (xenobiotics), such as polychlorobiphenyls (PCBs). To address
the challenge of cleaning up contaminated sites, there has been an increasing interest in
biological methodologies, collectively indicated as bioremediation, that take advantage
of the astonishing catabolic versatility of microorganisms to degrade or transform
contaminants to less toxic or nontoxic products. A promising bioremediation approach
is represented by the use of white-rot fungi, due to their unspecific, radical-based
degradation machinery that mainly operates in the extracellular environment
(mycoremediation).
A better understanding of the structure and functions of the microbial communities
of a given contaminated site and how they are affected by biotechnological
interventions, such as bioaugmentation with fungi and/or addition of mobilizing agents,
may assist in the design of more appropriate remediation strategies. In these respects,
the increased development of molecular-based techniques, mainly based on the isolation
and analysis of the genome of the entire microbial community in an environmental
sample (the so called ‘metagenome’), has allowed the direct investigation of
microorganisms in their natural environment without laboratory culturing and thus
allowing to mine the whole microbial diversity, including the vast uncultivable
majority.
Considering that white-rot fungi have been successfully employed in several
bioremediation trials but that little is known about whether and how the indigenous
microflora is affected by the massive inoculation with the allochtonous fungi, the aim of
the present Ph.D. thesis project was to investigate the structural and functional
modifications of the microbial communities in contaminated soils following
mycoremediation. In particular, several laboratory-scale trials have been implemented
on historically contaminated soils and model soils (ad hoc contamination) applying
different white-rot fungi, alone or in combination with mobilizing agents.
VII
Combined use of white-rot fungi and mobilizing agents for the remediation of a model
soil artificially contaminated with PAHs:
Bioremediation efficacy by microorganisms is strongly affected by the low water
solubility and bioavailability of PAHs and so the use of additives capable of mobilizing
these contaminants from the soil organic phase to the aqueous one has been shown to
positively influence their degradation. The first part of this thesis work was thus aimed
to evaluate the effect of mobilizing agents (MA) on mycoremediation efficiency and to
better understand the impact of this remediation strategy on the composition and
diversity of the indigenous bacterial community. The study was conducted in a model
system where a pristine soil was spiked with a mixture of seven PAHs (50 mg/g each of
phenanthrene, anthracene, fluoranthene, pyrene, chrysene, benzo[k]fluoranthene and
benzo[a]pyrene), to simulate a recent contamination, and subsequently incubated with
white-rot fungi (Irpex lacteus 617/93, Pleurotus ostreatus 3004, Allescheriella sp.
DABAC 1 and Phlebia sp. DABAC 9) and/or mobilizing agents, namely two
polyoxyethylenepolysorbates (Tween-20 and Tween-80), a plant seed oil characterized
by high concentration of polyunsaturated fatty acid (soybean oil, SO), olive-oil mill
wastewaters (OMW) and randomly methylated -cyclodextrins (RAMEB).
In the first part of this study Phlebia sp. and Allescheriella sp. have been used with
or without the addition of Tween 20, Tween 80 and SO. The two fungal strains
markedly differ for their growth capabilities under non-sterile conditions and without
MAs (3.0 vs. 0.1 μg ergosterol g-1 soil, for Phlebia sp. and Allescheriella sp.,
respectively). However, SO led to a 35-fold increase of Allescheriella sp. growth.
Contaminant degradations by Phlebia sp. and Allescheriella sp. were best supported by
SO and Tween 20, respectively. Interestingly, the highest level of soil detoxification, as
evaluated by assessing dehydrogenase activity, was reached following incubation with
Allescheriella sp. without the addition of any MA. In accordance with these findings,
enumeration of cultivable bacteria and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)
analysis of PCR-amplified 16S rRNA showed that microbial growth and biodiversity
were positively affected by remediation with white-rot fungi, and especially when
Allescheriella sp. was used.
In the second part of the study two white-rot fungi, namely Irpex lacteus and
Pleurotus ostreatus, were tested alone or in combination with five MAs (Tween-20,
Tween-80, SO, OMW, and RAMEB). Among the different MAs, SO best supported
fungal growth and positively affected PAH degradation and soil detoxification but,
VIII
interestingly, showed a negative effect on both bacterial biomass and biodiversity when
either one of the two fungi was used. It is worth noticing that even if both fungi showed
a general decrease of the total weight of contaminants and an increase of soil
detoxification in combinations with all MAs, their impact on endogenous bacteria was
different. Indeed, when the soil was incubated with P. ostreatus bacterial biodiversity
decreased and the type of MA used did not significantly affect the composition of the
indigenous microflora. By contrast, when I. lacteus was used as inoculum, the diversity
of the bacterial community increased and its structure was influenced by the type of MA
used. Finally, cloning-sequencing of PCR-amplified 16S rRNA genes suggested the
presence of well known PAH-degrading bacterial species belonging to the Bacillus e
Burkholderia genera.
Bioremediation of a historically contaminated soil with Botryosphaeria rhodina and
Pleurotus pulmonarius:
Two white-rot fungi, namely Botryosphaeria rhodina DABAC P82 and Pleurotus
pulmonarius CBS 664.97 were tested for their ability to grow and to degrade aromatic
hydrocarbons in an aged contaminated soil from the ACNA site (Cengio, SV, Italy), a
former industrial area, decommissioned in 1994, where large-scale production of a wide
array of organic chemicals had taken place for more than 100 years. The soil was
characterized by the concomitant presence of both aromatic hydrocarbons, including
chlorinated benzenes and anilines, thiophenes and polyaromatic hydrocarbons, and
heavy metals (mainly Hg, Cu and As). Previous studies had demonstrated the
unfeasibility of biostimulating the indigenous microflora to bioremediate this soil and
thus mycoremediation with white-rot fungi was attempted. To evaluate the role of the
indigenous microflora on the overall process, incubations were performed on both
fumigated and non-fumigated soils.
Fungal colonization by B. rhodina was unexpectedly lower in the fumigated than in
the non-fumigated soil while the growth of P. pulmonarius showed an opposite
response. Interestingly, degradation performances and detoxification by both fungi were
markedly higher in the non-fumigated soil than those observed in the fumigated one
suggesting an apparent synergistic effect occurring between the bioaugmented fungi and
indigenous soil microflora. Heterotrophic bacterial counts in nonfumigated soil
inoculated with either B. rhodina or P. pulmonarius were significantly higher than those
of the corresponding incubation control. To evaluate the effects of fungal
IX
bioremediation on the bacterial community structure, numerical analysis of DGGE
profiles of PCR-amplified 16S rRNA genes was performed. The bacterial community in
the original non-amended ACNA soil was characterized by a low biodiversity. The
amendment with sterilized maize stalks led to an augmentation of species richness and
to marked changes in the community structure. Bioaugmentation with both fungi further
increased the community diversity and resulted either in the appearance or in the
enrichment of dominant hydrocarbon-degrading species as suggested by cloning and
sequencing of 16S rRNA genes.
Structural and functional modifications of the indigenous bacterial community during
bioremediation of a historically contaminated soil with Panus tigrinus:
Bioremediation of the aged contaminated soil ACNA was further investigated using
the white-rot fungus Panus tigrinus. In this part of the thesis project a laboratory-scale
trial was setup to monitor the structural and functional modifications of the indigenous
bacterial community during mycoremediation. Analyses were performed at the
beginning of the experiment (t0) and after 7, 15, 30 and 60 days of incubation (t7, t15, t30
and t60).
Amendment of contaminated soil with milled maize stalks proved to be valuable for
the fungus growth under non-sterile conditions: the matrix was rapidly colonized within
the first two weeks, thus indicating good tolerance towards both organic contaminants
and heavy metals and capability to compete with the autochthonous microflora.
Moreover, and in spite of the non-favorable pH (around 7.4) and the presence of heavy
metals, P. tigrinus produced interesting lignin-modifying enzyme activities such as
laccase and Mn-peroxidase. Although bioremediation experiments were prolonged for
only 60 days, GC-MS analysis of the soil treated with P. tigrinus indicated removal or
strong reduction of several contaminants such as naphthalene, 1,2,3,4-
tetrachlorobenzene, 2,4- and 2,6-dichloroaniline, 2,3,4,5,6-pentachloroaniline,
diphenylether and 1,1’-binaphtalene. Heterotrophic bacterial counts and DGGE analysis
showed that the size and the diversity of the endogenous bacterial populations increased
during fungal bioaugmentation. Cluster analysis of DGGE fingerprints indicated that
bacterial populations in the incubation control and in the fungal-augmented soil during
the first fifteen days of incubation remained quite similar. On the contrary, after 30 and
60 days of incubation, a higher degree of diversification between incubation controls
and fungal treatments was evident suggesting a specific effect of P. tigrinus inoculation
X
on the endogenous bacterial community. Finally, to evaluate the impact of
mycoremediation on the bacterial community function, Real-Time PCR experiments
were performed targeting genes involved in the degradation of aromatic contaminants.
In particular, it was found that the copy number of both naphthalene dioxygenase and
catechol 2,3-dioxygenase genes tended to decrease over time in soils incubated with P.
tigrinus. This finding suggested the occurrence of a functional shift in soil microbial
populations, probably as a consequence of aromatic contaminant degradation, and thus
leading to a reduction in the relative abundance of specialized bacterial groups. Cloning
and sequencing of 16S rRNA genes further confirmed this hypothesis showing that
following remediation both specialized and opportunistic bacteria belonging to several
different genera were present.
Combined use of Panus tigrinus and soybean oil for the bioremediation of a soil
historically contaminated with polychlorinated biphenyls:
Based on the encouraging results obtained with the use of white-rot fungi for the
remediation of PAH-contaminated soils, the aim of the last part of the thesis work was
to evaluate a similar mycoremediation approach for the reclamation of a soil historically
contaminated with polychlorinated biphenyl (PCB). Indeed, PCBs are toxic xenobiotics
of great ecological concern present in large amounts throughout the environment, and in
particular in soils and sediments. A laboratory-scale mycoremediation trial with P.
tigrinus, alone or in combination with SO as mobilizing agent, was established and
analyses were performed at the beginning of the experiment (t0) and after 30 (t30) and 60
(t60) days of incubation. Colonization of P. tigrinus was clearly visible and also
confirmed by ergosterol quantification. Interestingly, ergosterol slightly increased in
non-inoculated incubation controls as well, suggesting the presence of a viable
indigenous fungal community. Extracellular enzymatic activities were detected in soil
inoculated with P. tigrinus. In particular, hydrolase activities peaked after 30 days of
incubation especially in the absence of SO. On the contrary, the use of the MA had
opposite effects on lignin-modifying enzyme activities: SO inhibited the production of
laccase but stimulated that of Mn-peroxidase. GC-MS analysis of PCB concentration in
the different soil samples showed that, as expected, there was a significant degradation
activity carried on by the endogenous microflora but that, interestingly, the addition of
the mobilizing agent negatively affected this activity. On the contrary, mycoremediation
with P. tigrinus did not lead to a significant PCB depletion. Nevertheless, heterotrophic
XI
bacterial counts and DGGE analysis of both 16S and 18S rRNA genes showed that the
size and the diversity of the bacterial and fungal communities increased following
incubation with the fungus and the mobilizing agents, suggesting a significant effect of
these biological interventions on the endogenous microflora. Real-Time PCR
quantification of catabolic genes, namely biphenyl dioxygenase and catechol 2,3-
dioxygenase, showed that the number of gene copies remained unchanged during the
incubation period, suggesting that treatment with P. tigrinus and/or SO did not affect
the function of the endogenous microbial community.
In conclusion, the results obtained during this thesis project confirmed the
importance of using white-rot fungi, alone or in combination with mobilizing agents, to
decontaminate and detoxify PAH-contaminated soils. On the contrary, more
investigations are needed to assess the validity of a similar strategy for the
bioremediation of soils polluted with PCBs. The detailed, culture-independent,
molecular-based analyses of soil microflora revealed that mycoremediation, both with
and without the use of mobilizing agents, had a profound effect on the structure and
function of the endogenous microbial communities. In particular, and with the only
exception of the use of Phlebia sp. in combination with SO, all fungi and all mobilizing
agents stimulated bacterial growth and enhanced bacterial biodiversity. Furthermore,
when the mycoremediation of the soil was successful, also the function of the bacterial
community seemed to undergo a shift toward a less specialized role. Taken together
these results point out the importance of gaining insights about the ecological effects of
biotechnological interventions, particularly those involving bioaugmentation with fungi,
on the endogenous microbial populations in order to design more integrated, successful
bioremediation strategies.
Description: 
Dottorato di ricerca in Evoluzione biologica e biochimica
URI: http://hdl.handle.net/2067/1110
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