Isoprene: from the cell to the environment

Abstract

One of the most relevant aspects reported in the last Intergovernmental Panel on Climate Change is represented by the projections of global warming as well as the consequent possible effect of rising temperature on ecosystems. The expected negative impacts of global climate change makes it very important to generate crop and forest plants that will have enhanced resistance and tolerance to environmental stress conditions and, in particular, to the combined stress caused by sunlight, and rising temperature and drought. Drought and high temperatures are often concurrent factors in nature, and the combined effect of these two environmental constraints should be determined. Moreover, current global change models predict that lower frequency of rainfall days and longer dry intervals associated with atmospheric warming will affect large areas of the globe. Thus, it is of paramount importance to study the acclimatory responses of plants to the interactive effects between water stress and rising temperature. Drought and temperature represent the main rising variables of the global warming, which could affect not only the plant response to environmental stress conditions, but also the atmospheric chemistry. This is particularly true if we apply it to the forest ecosystems. Terrestrial vegetation, especially tropical rain forest, releases vast quantities of carbon as volatile organic compounds (VOC) into the atmosphere of which the most important is isoprene. The emissions of these volatile isoprenoids are strictly dependant on environmental factors and they are highly reactive with correspondingly short lifetimes. Volatile isoprenoids can be removed by oxidation reactions; this reactions chain is mainly initiated by hydroxyl radicals (OH),primarily formed through the photo-dissociation of ozone. The consequence of forest degradation, especially in the Amazon region,would be to reduce the VOC emissions, with a subsequent impact on ozone levels at the surface. As pointed out by Betts et al. (2008) “Isoprene emissions have a significant impact on the projected future surface ozone levels. Ignoring vegetation changes has meant that future simulated ozone levels were greater by 5-10 ppbv, owing to larger isoprene emissions. This may have implications for air quality in the region, with potential implications for the health of humans, animals, ecosystems and crops”. All together, these considerations reveal the possible impact of volatiles isoprenoids, and in particular isoprene, on the ecosystems, especially on forest ecosystems. These metabolites are involved in numerous biological processes, such as electron transport, photosynthesis, hormonal regulation, membrane fluidity, and plant defense responses, or communication with other organisms. In planta, isoprene is considered an important molecule for ameliorating abiotic stresses. Isoprene may increase thermotolerance particularly when leaves are exposed to transiently high temperatures. Despite the large convincing experimental evidences, the mechanism by which isoprene exerts its protective action is not completely understood. The impact of drought on isoprene emission has also been studied, since drought is a major limitation for plant growth worldwide, and the intensity and frequency of drought conditions is going to increase with current and future climate change. The available evidence suggests that isoprene biosynthesis is relatively unaffected by drought. Episodes of severe drought stress may lead to suppression of photosynthesis, while isoprene emission is only slightly reduced. While numerous isoprenoids are formed in and emitted by leaf chloroplasts, where they likely exert their protective action, plants also emit volatile compounds from their flowers. The (E)-􀀁- caryophyllene synthase (TPS27) catalyzes the formation of (-)-(E)-􀀁- caryophyllene the major sesquiterpene emitted from Arabidopsis floral tissues. It has been hypothesized that (E)-􀀁-caryophyllene can play a role in the attraction of floral visitors, leading to low levels of cross-pollination and increasing reproductive fitness in natural populations. However, given the low levels of volatile emission, it is quite possible that the (E)-􀀁-caryophyllene biosynthesis have a function besides, or in addition to, pollinator attraction.􀀁Though recent studies support that constitutive (e.g. isoprene, monoterpenes and sesquiterpenes) terpene volatiles released from vegetative tissues of different plant species exposed to abiotic stress could serve as mediators of thermotolerance or in protecting cells against oxidative stress, there is limited information available about the possible roles of sesquiterpenes in the physiological response of plants to environmental stress conditions. Many questions about the biological functions of isoprenoids are still open. Even when considering the large amount of studies on the ecological and physiological impact of the isoprenoids release into the atmosphere from vegetation, there is only partial and incomplete information about function, biosynthesis, and regulation of these compounds in the plant cell. It is important to fill this “gap” especially when considering the important role played by these compounds in the defense system against environmental stress. In particular isoprene seems to protect leaves from high temperature and oxidative damages. Given the specific and active function of isoprene in the plant defense system, it is expected that isoprene biosynthesis be specifically and strongly regulated. The goal of this work is to provide an answer to some of these points not yet clarified. Using different plant species and different experimental approaches we will try to elucidate the regulation of isoprene function in the nature; it will be shown that isoprene is able to enhance thermo-tolerance also in plants which naturally do not emit isoprene (like Arabidopsis), and that this protective role is not only directly played, scavenging ROS excess or helping membrane stability, but has also an indirect component, priming the defense system against thermal and oxidative stress. New biophysical evidences supporting the hypothesis that isoprene may also be able to directly interact with chloroplastic membranes increasing their stability during the stress are also presented. Similarly to isoprene, many questions regarding another class of isoprenoids, the sesquiterpenes, are still open. Genetically engineered model plant species, such as Arabidopsis thaliana, overexpressing enzymes that regulate sesquiterpene biosynthesis in plants, may constitute a suitable tool to study the physiological role of sesquiterpenes in plants. Following this line, a characterization of the plants overexpressing the TPS27 gene will be shown, and how those plants respond to environmental stress, compared to wild-type plants, will be assessed. We used this tool to demonstrate that (E)-􀀁- caryophyllene is able to enhance plant thermotolerance, and also that this protective role is triggered by similar mechanisms to those suggested for isoprene. Finally, all together these results reveal a pattern that could be assimilated to that also obtained with the Arabidopsis plants transformed to overexpress the isoprene synthase gene. We can surmise that all volatile isoprenoids exert a similar protective action increasing plant resistance to high temperatures. Looking beck the results obtained with isoprene and (E)-􀀁-caryophyllene, looking on the recent variety of works on these and other isoprenoids, and also on the evolutionary history of isoprenoid biosynthesis, it is possible that plants emit volatile compounds, as a part of the secondary metabolism, combining them to release a bland of molecules with specific functions, independently from the plant species. Plants have been developed evolving their capacity to regulate more and more finely the biosynthesis of even more specific family of isoprenoids to better respond to specific environmental. Therefore, filogenetically distant compounds, like isoprene (an hemiterpene) and (E)-􀀁-caryophyllene (a sesquiterpene), synthesized and emitted by the same plant produce similar effect, showing the same biological function of thermal protection. This ‘merging’ hypothesis brings beck the explanations, not only the thermo-tolerance, for the isoprenoid emission to a unique multiple biological function: protection of plants against the environmental stress conditions, and enhancement of the plant fitness. The ‘merging’ hypothesis overlap isoprenoids coming from different plant species suggesting that the biosynthesis and utilization or not of a specific volatile compound in two different species should not be attributable to the fact that this compound may be or not ‘waste of carbon’, but because that plants have evolved in a different way, adapting their emission pattern to different environments, and, consequently, selecting different isoprenoids to respond to similar phenomenon.

Uno degli aspetti più rilevanti riportato nell’ultimo IPCC è rappresentato sia dalle proiezioni sul riscaldamento globale come dal possibile effetto sugli ecosistemi dell’innalzamento della temperatura. L’atteso impatto negativo del cambiamento climatico globale evidenzia l’importanza di poter generare piante d’interesse agroalimentare e forestale in grado di tollerare condizioni più aspre di stress ambientale, in particolare dagli effetti combinati di alta temperatura e siccità. Tali fenomeni, in natura, sono spesso interconnessi, e i loro effetti dovrebbero essere attentamente monitorati. Oltretutto, è da tenere in considerazione il fatto che gli attuali modelli sui cambiamenti climatici predicono che la compartecipazione tra la riduzione della frequenza di eventi piovosi e l’allungamento degli intervalli di siccità, associati al riscaldamento atmosferico, potrebbero colpire vaste aree del globo. Ciò considerato, è di primaria importanza studiare la risposta delle piante agli effetti interattivi dello stress idrico e delle alte temperature. Siccità e temperatura rappresentano, infatti, le variabili descriventi il riscaldamento globale che più delle altre potrebbero incrementare, e il cui incremento colpirebbe non solo la risposta delle piante a condizioni di stress, ma anche la chimica dell’atmosfera. Questa previsione è particolarmente vera se applicata agli ecosistemi forestali. La vegetazione terrestre, specialmente le foreste pluviali tropicali, rilasciano nell’atmosfera larghe quantità di carbonio sotto forma di composti volatili organici (VOC), il cui maggior rappresentante è l’isoprene. L’emissione di questi composti è strettamente legata a fattori ambientali, ed essi sono tanto rettivi quanto hanno una ridotta emivita. Gli isoprenoidi volatili possono essere rimossi da reazioni di ossidazione, le quali sono principalmente iniziate da radicali idrossilici (OH), di solito formati dalla foto-dissociazione dell’ozono. Una conseguenza della deforestazione, specialmente nella regione amazzonica, potrebbe essere una ridotta emissione di VOC, con un conseguente impatto sui livelli superficiali di ozono. Come evidenziato da Betts et al. (2008) <Le emissioni di isoprene hanno un impatto significativo sulle proiezioni future dei livelli superficiali di ozono. Ignorare i cambiamenti della vegetazione ha significato che i livelli di ozono in seguito simulati furono superiori di circa 5-10 ppbv, a causa delle maggiori emissioni di isoprene. Questo può avere implicazioni sulla qualità dell’aria in quella regione, con implicazioni potenziali sulla salute di uomini, animali, ecosistemi e raccolti>. Tali considerazioni ci rivelano il possibile impatto degli isoprenoidi volatili, in particolare l’isoprene, sugli ecosistemi, in particolar modo su quelli forestali. Questi metaboliti sono coinvolti in numerosi processi biologici,quali il trasporto elettronico, la fotosintesi, la regolazione ormonale, la fluidità di membrana, i sistemi di difesa delle piante, come anche la comunicazione con altri organismi. Nelle piante l’isoprene in particolare è considerato un’importante molecola nel migliorare la risposta a stress abiotici. L’isoprene, infatti, può incrementare la termo-tolleranza, in particolare quando le foglie sono esposte a transienti periodi di alte temperature. A dispetto delle numerose e convincenti evidenze sperimentali a supporto di tale ipotesi, il meccanismo con cui l’isoprene esercita il suo ruolo protettivo non è stato ancora del tutto chiarito. Anche l’impatto della siccità sull’emissione d’isoprene è stato affrontato, considerando che tale stress rappresenta uno dei maggiori fattori limitanti lo sviluppo delle piante nel mondo, e che l’intensità e la frequenza di condizioni di siccità andrà a incrementare in risonanza all’attuale e futuro cambiamento climatico globale. Le attuali conoscenze suggeriscono che la sintesi d’isoprene non sia influenzata dalla siccità; cicli di forte stress idrico, che possono indurre una notevole diminuzione della fotosintesi, riducono solo parzialmente l’emissione d’isoprene. Sebbene numerosi isoprenoidi siano formati ed emessi dai cloroplasti a livello fogliare, dove essi esercitano la loro azione protettrice, altri composti volatili, come i sesquiterpeni, sono emessi anche dagli organi floreali. L’(E)-􀀁-cariofillene sintasi (TPS27)catalizza la formazione del (-)-(E)-􀀁-cariofillene, il maggior sesquiterpene emesso dall’apparato floreale di Arabidopsis. È stato ipotizzato che l’(E)-􀀁-cariofillene possa giocare un ruolo rilevante nell’attrarre insetti, contribuendo al mantenimento di un basso livello di impollinazione incrociata ed incrementando la fitness riproduttiva nelle popolazioni naturali. Tuttavia, considerando i bassi livelli di emissione degli isoprenoidi volatili, è possibile che la biosintesi di (E)-􀀁-cariofillene possa avere una funzione nella o in aggiunta all’attrazione d’insetti impollinatori. A dispetto dei recenti studi a supporto dell’idea che la sintesi di terpeni volatili costitutivi (come isoprene, monoterpeni e sesquiterpeni) rilasciati dai tessuti vegetativi di differenti specie vegetali esposte a stress abiotico, possa mediare la termo-tolleranza o la protezione delle cellule dallo stress ossidativo, ci sono solo limitate informazioni disponibili sui possibili ruoli dei sesquiterpeni nella risposta fisiologica delle piante a condizioni di stress ambientale. Molte delle questioni riguardanti le funzioni biologiche degli isoprenoidi sono ancora aperte. Pur considerando la cospicua mole di studi fatti sull’impatto ecologico e fisiologico del rilascio in atmosfera degli isoprenoidi dalla vegetazione, attualmente è disponibile solo una parziale ed incompleta informazione riguardo la funzione, la biosintesi e la regolazione di tali composti a livello cellulare. Sarebbe importante poter riempire questo “gap”specialmente considerando il ruolo primario giocato da questi composti nel sistema difensivo delle piante contro stress ambientali. Particolarmente rilevante sembra essere, infatti, il ruolo dell’isoprene nel proteggere le foglie dai danni provocati dalle alte temperature e da condizioni di stress ossidativo. Data la specifica e attiva funzione dell’isoprene nel sistema difensivo delle piante, è ipotizzabile che la sintesi dell’isoprene sia regolata in modo altamente specifico. L’intento di questo lavoro è di fornire una risposta ad alcuni di questi punti ancora non del tutto chiariti. Utilizzando differenti specie vegetali e differenti approcci sperimentali abbiamo cercato di far luce sulla regolazione della funzione dell’isoprene in natura. Sarà mostrato che l’isoprene è in grado di incrementare la termotolleranza anche in piante che naturalmente non lo emettono (come piante di Arabidopsis thaliana ingegnerizzate per esprimere il gene dell’isoprene sintasi). Sarà dimostrato che tale ruolo protettivo non è giocato solo direttamente, detossificando l’eccesso di specie reattive dell’ossigeno (ROS) o aiutando la stabilità di membrana, ma anche in modo indiretto, attivando, già prima dell’accorrere di uno stress, il sistema di difesa specifico contro alte temperature e stress ossidativo. Saranno presentate inoltre nuove evidenze biofisiche a supporto dell’ipotesi che l’isoprene può essere in grado di interagire direttamente con le membrane cloroplastiche incrementandone la stabilità durante lo stress. Come per l’isoprene, molte domande su di un’altra classe d’isoprenoidi, i sesquiterpeni, sono ancora senza risposta. L’uso di specie modello geneticamente modificate, come Arabidopsis, per esprimere in modo costitutivo gli enzimi che regolano la biosintesi degli isoprenoidi nelle piante, può rappresentare un valido strumento d’indagine del ruolo fisiologico anche dei sesquiterpeni vegetali. Seguendo questo percorso, sarà presentato in questo lavoro una caratterizzazione di piante di Arabidopsis ingegnerizzate per esprimere in modo costitutivo il gene TPS27, e come tali piante rispondono agli stress ambientali rispetto a piante selvatiche. Abbiamo utilizzato questo strumento per dimostrare che (E)-􀀁- cariofillene è in grado di incrementare la termo-tolleranza delle piante, ed anche che questo ruolo protettivo è innescato da meccanismi simili a quelli suggeriti per l’isoprene. Infine, l’analisi d’insieme dei risultati ottenuti, ci ha suggerito la possibilità che ci possa essere un percorso tanto funzionale quanto regolativo assimilabile a quello attenuto analizzando i dati raccolti con le piante di Arabidopsis ingegnerizzate per esprimere il gene dell’isoprene sintasi. Possiamo quindi ipotizzare che tutti gli isoprenoidi volatili esercitino un’azione protettiva simile, incrementando la protezione contro le alte temperature. Ripercorrendo i risultati ottenuti con l’isoprene e (E)-􀀁-cariofillene, guardando anche ai recenti lavori pubblicati su questi e altri isoprenoidi, ed infine analizzando anche la storia evolutiva della sintesi degli isoprenoidi, risulta possibile, o quantomeno ipotizzabile, che le piante emettano composti volatili,come parte del loro metabolismo secondario, combinandoli per rilasciare una miscela di molecole con specifiche funzioni,indipendentemente dalla specie vegetale. Le piante si sarebbero evolute sviluppando la loro capacità di regolare via via più finemente la biosintesi di una sempre più specifica famiglia d’isoprenoidi, per rispondere sempre meglio a specifiche condizioni ambientali. Oltretutto, composti filogeneticamente distanti come l’isoprene (un emiterpene) e (E)-􀀁-cariofillene (un sesquiterpene), sintetizzati ed emessi dalla stessa pianta, producono effetti simili, mostrando la stessa funzione biologica termo-protettrice. Questa ipotesi “concatenante” lega insieme le spiegazioni, non solo quella della termo-tolleranza, per spiegare l’emissione d’isoprenoidi verso un’unica molteplice funzione biologica: protezione delle piante da condizioni di stress ambientale e incremento della loro fitness. L’ipotesi “concatenante” racchiude gli isoprenoidi provenienti da differenti specie vegetali, suggerendo che sia la sintesi quanto l’uso o meno di uno specifico composto volatile da parte di due specie diverse non dovrebbe essere imputato al fatto che tale composto possa essere o no carbonio “spazzatura”, ma perché quelle piante si sono evolute seguendo vie differenti, adattando i loro profili di emissione a differenti condizioni ambientali e, di conseguenza,selezionando differenti isoprenoidi per rispondere a fenomeni simili.