Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/1094
Title: Control of phytopathogenic fungi in horticultural crops by natural plant extracts
Other Titles: Controllo dei funghi fitopatogeni nelle colture ortive mediante estratti vegetali naturali
Authors: Švecová, Eva
Keywords: Fungal diseases;Biological control;Natural products;Malattie fungine;Controllo biologico;Prodotti naturali;AGR/04
Issue Date: 19-Mar-2010
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 22. ciclo
Abstract: 
Fungal pathogens represent a constant threat for vegetable crops under field and
protected conditions. Historically, losses of crop yield from fungal diseases have had severe
effects even on the human race causing famines and epidemics. Therefore, the proper
management of fungal diseases is of global importance. Even today many of these diseases
are difficult to control. In addition, some fungi have developed resistance against certain
fungicides. Therefore, other alternatives to manage plant pathogenic fungi are of main
interest. Recently, plant extracts represent a valid possibility for managing fungal diseases as they are a natural source of antifungal compounds.
In the present thesis, methanolic extracts of five plants such as Siparuna guianensis
(Monimiaceae), Cordia leucocephala (Boraginaceae), Boerhavia diffusa (Nyctaginaceae), Vitex agnus-castus (Verbenaceae), and Phyllanthus niruri (Euphorbiaceae) were screened for
their antifungal activity under both in vitro and in vivo conditions. All these plants come from tropical or subtropical regions, some of them with known antimicrobial properties commonly
used in indigenous medicine throughout the world. Nevertheless, no reports on their activity against fungal plant pathogens have been still reported in literature. Once identified the extract effective to a specific host-pathogen interaction, this was studied with innovative
methodologies by use of flow cytometry and gene expression analysis.
All plant extracts tested showed antifungal activity against phytopathogenic fungi
under in vitro conditions. The percentage of mycelial growth inhibition increased with the
concentration of plant extract. Only some extracts were efficient under in vivo conditions too.
S. guianensis extract reduced mycelial growth of Botrytis cinerea and Ascochyta
rabiei at the concentration of 6 ml·l-1, as confirmed also by detached tomato leaf assay. In addition, it inhibited completely spore germination at the concentration of 6 and 3 ml·l-1 for B. cinerea and A. rabiei, respectively. In greenhouse tests, S. guianensis extract was efficient to
control gray mold in cucumber leaves and young tomato plants at the concentrations of 3 ml·l-1 and 6 ml·l-1, respectively. However, the extract had no efficiency in controlling B. cinerea on strawberry and on young cucumber plants and fruits. S. guianensis extract significantly
controlled Ascochyta blight in chickpea at all concentrations tested.
C. leucocephala extract inhibited fungal growth of three Fusarium spp. at the
minimum inhibitory concentration (MIC) of 7 ml·l-1 for F. oxysporum f. sp. basilici, and 14 ml·l-1 both for F. oxysporum f. sp. lycopersici and F. oxysporum f. sp. melonis. Extract concentration of 7 ml·l-1 inhibited of 92 and 99 % spore germination of F. oxysporum f. sp. lycopersici and F. oxysporum f. sp. melonis, respectively. Tomato plants treated with the
extract of C. leucocephala at all concentrations showed significant reduction of disease development respect to the inoculated control. Significant inhibitory effect on Fusarium wilt in melon was observed after treatments by high concentrations of plant extract. In addition, its efficiency increased when applied immediately after inoculation. The plant extract did not
control Fusarium wilt in basil.
B. diffusa extract inhibited mycelial growth of both P. infestans and P. cactorum at the
concentrations of 2.5 ml·l-1, and 10 ml·l-1 for P. capsici. The extract had fungitoxic effect on the mycelial growth of P. infestans and P. cactorum. At the concentrations of 2.5 ml·l-1 and 5
ml·l-1, showed a moderate inhibition effect against P. infestans in tomato plants. B. diffusa extract reduced also disease symptoms of P. capsici in pepper at all concentrations but the concentration of 10 ml·l-1 showed the best efficacy in controlling the oomycete.
V. agnus-castus extract showed strong antifungal activity against Pythium ultimum.
The extract delayed the mycelial growth of the 7 day cultured fungus in comparison with the control; the minimal inhibitory concentration was 2 ml·l-1. In addition, V. agnus-castus extract showed significant antifungal activity against P. ultimum on tomato seedlings.
P. niruri extract, at the concentration of 16 ml·l-1, was fungitoxic on Monosporascus
cannonballus. Minimum inhibitory concentration was 8 ml·l-1. Although P. niruri extract had no significant inhibition effect on M. cannonballus in melon plants under greenhouse conditions, an improvement of general health status of the plants was observed when treated with P. niruri extract at the concentration of 28 ml·l-1.
As the efficiency of the extracts of B. diffusa and V. agnus-castus under greenhouse
conditions was comparable to that of synthetic fungicides, these extracts can be considered as potential valuable alternatives to chemical control of P. capsici and P. ultimum, respectively.
Additionally and after the screening of the different plant extracts on various hostpathogen interactions, the antifungal activity of selected extracts was studied by innovative techniques. The effect of C. leucocephala extract against F. oxysporum f.sp melonis was investigated by flow cytometry, an innovative method for antifungal screening. Cytometric
analysis of over time fungal development dynamics was verified also by microscope
observations. It was possible to observe an immediate effect of plant extract on spore
viability; the extract at the concentration of 14 ml·l-1 inhibited completely spore germination.
The technique showed many advantages in comparison with classical methods of antifungal screening, especially higher velocity and precision. Therefore, flow cytometry can be considered as a valuable method for screening antifungal activity of plant extracts enabling to determine the interaction of the tested fungus with the plant extract in early stages of fungal
growth.
To determine the involvement of plant extract in pathogenesis-related (PR) gene
induction, tomato seedlings were treated with Vitex agnus-castus and/or inoculated with Pythium ultimum. The expression of four PR genes (PR-1, PR-4, PR-5, PR-6) was monitored for 48 hours after treatments and artificial inoculations. The treatments with plant extract resulted in significant activation of genes encoding PR-1 and PR-4 proteins already after three
hours. The amount of PR genes expressed in the plants treated both with plant extract and fungus increased over time, while decreased in the plants treated just with plant extract.
Twenty-four hours after treatments, PR-1, PR-4, and PR-6 genes were activated very strongly in plants treated with both plant extract and fungus, and the expression increased also 48 hours after the treatments. These results indicated that the plant extract contributes to the
activation of plant defence mechanisms. Apart the direct induction of PR genes, the extract acted also as a priming agent conferring to the plant enhanced defence responses upon pathogen inoculation. The activation of various PR genes suggests that the induction of defence responses by V. agnus-castus extract in tomato can be regulated by more signalling pathways.

I patogeni fungini rappresentano una minaccia costante per le colture orticole sia in
campo che in ambienti protetti. Le perdite in resa produttiva dovute alle malattie fungine
hanno avuto storicamente un impatto importante sull'intera umanità, causando carestie ed
epidemie varie. La corretta gestione della difesa dalle malattie fungine è pertanto di grande
importanza e anche oggi molte di queste malattie sono difficili da controllare. Alcuni funghi
hanno inoltre sviluppato resistenza verso i fungicidi e, in molti casi, non sono disponibili
resistenze genetiche in grado di controllarli. Di consequenza, è di grande interesse individuare
alternative valide per il controllo di funghi fitopatogeni. A riguardo, l’impiego di estratti
vegetali sono una fonte naturale di sostanze antifungine e potrebbe quindi risultare
potenzialmente utile per il controllo delle malattie fungine.
Nella presente tesi, è stato effettuato sia in vitro che in vivo uno screening iniziale per
studiare l’attività antifungina di estratti metanolici ottenuti da cinque piante quali Siparuna guianensis (Monimiaceae), Cordia leucocephala (Boraginaceae), Boerhavia diffusa
(Nyctaginaceae), Vitex agnus-castus (Verbenaceae), e Phyllanthus niruri (Euphorbiaceae).
Una volta individuato l’estratto più efficace verso una specifica interazione ospite-patogeno, è
stato approfondito il suo studio utilizzando metodologie innovative basate sull’impiego della
citofluorimetria a flusso e sull’induzione dell’espressione genica a livello molecolare. Tutte le piante da cui sono stati ottenuti gli estratti naturali provengono dagli ambienti tropicali o subtropicali, alcune delle quali hanno note proprietà antimicrobiche e sono comunemente utilizzate in medicina nelle diverse parti del mondo. Tuttavia, non è stata ancora riportata in letteratura la loro l'attività antifungina verso i fitopatogeni.
Tutti gli estratti vegetali saggiati hanno mostrato attività antifungina verso i funghi
fitopatogeni in condizioni di coltura in vitro. La percentuale di inibizione della crescita del
micelio è aumentata con l’aumentare della concentrazione dell'estratto. Solo alcuni degli
estratti sono stati efficienti anche se applicato su pianta in vivo.
In particolare, l'estratto di S. guianensis alla concentrazione di 6 ml·l-1 ha ridotto la
crescita del micelio di Botrytis cinerea e Ascochyta rabiei in vitro, come confermato anche
dal saggio in vivo su foglia staccata di pomodoro. Questo estratto, alle concentrazioni di 6 ml·l-1 e 3 ml·l-1, ha inoltre inibito completamente la germinazione delle spore di entrambi i funghi. L'estratto di S. guianensis è stato efficace anche per il controllo della muffa grigia in vivo su foglie di cetriolo e su piantine di pomodoro rispettivamente alle concentrazioni di 3 e 6 ml·l-1. Tuttavia, l'estratto non ha avuto alcuna efficacia nel controllare B. cinerea su fragola,
e su frutti e piantine di cetriolo. L'estratto di S. guianensis, a tutte le concentrazioni
considerate, ha controllato invece significativamente A. rabiei in cece.
L'estratto di C. leucocephala ha inibito la crescita di tre specie di Fusarium alla
minima concentrazione inibente di 7 ml·l-1 per F. oxysporum f.sp. basilici e di 14 ml·l-1 per F.
oxysporum f.sp. lycopersici e F. oxysporum f.sp. melonis. Alla concentrazione di 7 ml·l-1,
l'estratto ha inibito la germinazione delle spore di F. oxysporum f.sp. lycopersici e F.
oxysporum f.sp. melonis rispettivamente del 92 e 99%. Tutte le concentrazioni applicate di
estratto hanno inoltre ridotto significativamente lo sviluppo della tracheomicosi rispetto al
controllo inoculato in pomodoro. Le concentrazioni più elevate di estratto vegetale hanno determinato un effetto significativo sulla tracheofusariosi del melone; l’efficienza dell’estratto è aumentata se applicato immediatamente dopo l'inoculazione. L'estratto non è stato mai in grado di controllare la fusariosi del basilico.
L’estratto di B. diffusa ha inibito la crescita del micelio di P. infestans e P. cactorum
alla concentrazione di 2,5 e 10 ml·l-1 di P. capsici. L'estratto ha avuto un effetto fungitossico sulla crescita del micelio dei primi due funghi mentre, alla concentrazione di 2,5 e 5 ml·l-1, ha mostrato un moderato effetto di inibizione verso P. infestans in pomodoro. Lo stesso estratto, a tutte le concentrazioni, ha ridotto i sintomi di P. capsici in peperone e la concentrazione di 10 ml·l-1 ha evidenziato la massima efficacia nel controllo dell'oomycete.
L’estratto di V. agnus-castus, alla concentrazione minima inibente di 2 ml·l-1, ha
mostrato un’attività antifungina piuttosto elevata nei confronti di P. ultimum. L'effetto
inibente è stato confermato significativamente anche su piantine di pomodoro. L’estratto di P.
niruri, alla concentrazione di 16 ml·l-1, ha avuto invece un effetto fungitossico verso
Monosporascus cannonballus in vitro. La concentrazione minima inibitente è stata quella di 8 ml·l-1. Sebbene non sia stato evidenziato alcun effetto significativo verso M. cannonballus in melone, è stato comunque osservato un miglioramento dello stato di salute delle piante dopo il trattamento con l'estratto alla concentrazione di 28 ml·l-1.
Siccome l'efficienza degli estratti di B. diffusa e V. agnus-castus in condizioni di serra
è stata paragonabile a quella dei fungicidi sintetici, si può ipotizzare di utilizzare questi estratti come alternativa potenziale valida per il controllo rispettivamente di P. capsici e P. ultimum.
Una volta individuata l’attività antifungina dell'estratto di C. leucocephala verso F.
oxysporum f.sp. melonis e quella di V. agnus-castus nei confronti di P. ultimum, si è
proceduto ad approfondire con metodologie innovative le interazioni di questi estratti con i
funghi fitopatogeni. E’ stata quindi studiata, con l'impiego della citoflorimetria a flusso, un
metodo innovativo applicato all’interazione C. leucocephala / F. oxysporum f.sp. melonis. I
risultati delle analisi citometriche della dinamica dello sviluppo fungino nel corso del tempo sono state verificate anche mediante le osservazioni al microscopio. E’ stato pertanto possibile rilevare un effetto immediato dell'estratto vegetale sulla vitalità delle spore; alla concentrazione di 14 ml·l-1, la germinazione delle spore è stata inibita completamente. La tecnica ha dimostrato molti vantaggi rispetto ai metodi classici di screening antifungino, tra cui l'elevata velocità e la precisione. La citoflorimetria può essere quindi considerata come uno strumento valido per lo screening antifungino di estratti vegetali che consente di osservare l'interazione tra fungo ed estratto vegetale nei primi stadi di crescita fungina.
Per individuare l'eventuale ruolo dell’estratto vegetale sul controllo di funghi patogeni
nell'induzione dei geni codificanti le proteine legate alla patogenesi (PR), le piantine di
pomodoro sono state trattate con l'estratto di V. agnus-castus e/o inoculate con P. ultimum.
L'espressione di quattro geni PR (PR-1, PR-4, PR-5, PR-6) è stata monitorata per 48 ore dopo
i trattamenti e le inoculazioni artificiali. I trattamenti con l'estratto vegetale, già dopo tre ore, hanno portato ad una significativa attivazione dei geni codificanti le proteine PR-1 e PR-4. La quantità dei geni PR espressi nelle piante trattate sia con l'estratto vegetale che con il fungo è aumentata nel corso del tempo mentre è diminuita nelle piante trattate solo con l'estratto vegetale. Ventiquattro ore dopo i trattamenti, i geni PR-1, PR-4, e PR-6 sono stati attivati nelle piante trattate sia con l'estratto che con il fungo e l'espressione è aumentata ancora 48 ore dopo i trattamenti. Questi risultati indicano che l'estratto vegetale contribuisce all'attivazione dei meccanismi di difesa delle piante. A parte l'induzione diretta dei geni PR, l'estratto ha agito anche mediante un effetto priming, conferendo alla pianta la capacità di rispondere in maniera significativa all'inoculazione dei patogeni. L'attivazione dei diversi geni PR ha inoltre suggerito che le risposte della pianta relative alla difesa indotta dall’estratto di V. agnus-castus in pomodoro possono essere regolate da più vie di segnalazione.
Description: 
Dottorato di ricerca in Ortoflorofrutticoltura
URI: http://hdl.handle.net/2067/1094
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