Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/1080
Title: Cell growth density affects the structural and functional properties of Caco‐2 differentiated monolayer
Other Titles: La densità della crescita cellulare influenza le proprietà funzionali e strutturali del monostrato differenziato delle cellule Caco-2
Authors: Natoli, Manuela
Keywords: Caco-2;Microarray;Cell cycle;Tight junctions;Molecular endpoints;Ciclo cellulare;Giunzioni strette;Endpoints molecolari;BIO/11
Issue Date: 16-Mar-2010
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 22. ciclo
Abstract: 
The human intestinal Caco-2 cell line has been extensively used as a model of the
intestinal barrier. However, it is widely reported in literature that culture-related conditions, as well as the different Caco-2 cell lines utilized in different laboratories, often lead to problems of
reproducibility making difficult to compare results. We developed a new cell-growth protocol in which Caco-2 cells were subcultured at 50% of confluence (Low Density, LD) instead of 90% of
confluence, as usually reported in literature (High Density, HD). Using this new protocol, Caco-2 cells retained a higher proliferation potential resulting in a cell population, which, reaching confluence was able to differentiate almost synchronously, forming a more homogeneous and
perfectly polarized cell monolayer, as compared to that obtained with the HD cells. This comparison has been done by analyzing the gene expression and the structural characteristics of the 21-days differentiated monolayers by microarrays hybridization and by confocal microscopy.
We then investigated if these differences could also modify the effects of toxicants on 21-days-differentiated LD and HD cells. We analyzed the 2 hours-acute toxicity of CuCl2 in terms of actin depolymerization and MT2A (metallothionein 2A) and HSPA1A (heat shock protein 70) genes induction. Copper treatment resulted in different levels of actin depolymerization and gene
expression induction in relationship with the culture protocol, the LD cells showing a more homogeneous and stronger response. Our results suggest that cell growth density could influence a number of morphological and physiological properties of differentiated Caco-2 cells and these
effects must be taken in account when these cells are used as intestinal model.

Le cellule intestinali umani Caco-2 sono largamente utilizzate come modello in vitro della
barriera intestinale negli studi di farmacocinetica e farmacodinamica; tuttavia in letteratura è riportata l’alta variabilità di questo modello riguardo alle condizioni di coltura cellulare e i cloni di Caco-2 che sono utilizzati. In questo lavoro è stato sviluppato un nuovo protocollo di mantenimento della linea cellulare che prevede la sottocoltura delle cellule quando nella piastra di coltura si raggiunge il 50% di confluenza (Low Density, LD) piuttosto che il consueto 90%
(High Density, HD) riportato in letteratura.
Utilizzando questo protocollo (LD) le cellule Caco-2 mantengono un alto potenziale
proliferativo che produce un’omogeneità nell’inizio del differenziamento e quindi una
strutturazione più omogenea del monostrato cellulare durante e alla fine del differenziamento.
Abbiamo quindi condotto uno studio di comparazione delle cellule Caco-2 LD e HD a livello morfologico tramite microscopia confocale e a livello genico tramite la tecnologia microarray.
In seguito abbiamo condotto uno studio fisiologico di risposta tossica andando ad
analizzare le differenze tra le cellule HD e LD durante e dopo l’esposizione del monostrato
differenziato a concentrazioni crescenti di cloruro di rame. Abbiamo analizzato nelle due ora la depolimerizzazione dell’actina filamentosa tramite microscopia e l’induzione genica di
metallotioneina 2A (MT2A) e heat shock protein 70 (HSPA1A). Il trattamento con rame ha
evidenziato una differente sensibilità del modello alle concentrazioni utilizzate con una risposta fisiologica più omogenea nelle cellule LD.
In conclusione i nostri risultati suggeriscono una diretta influenza delle procedure di
mantenimento della linea cellulare sulle caratteristiche morfologiche e fisiologiche delle cellule Caco-2; queste differenze non possono quindi essere trascurate nel momento in cui questa linea cellulare è utilizzata come modello intestinale umano in vitro negli studi di predittività dei farmaci.
Description: 
Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellulare
URI: http://hdl.handle.net/2067/1080
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