Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/108
Title: Lipossigenasi e sopravvivenza cellulare in linee tumorali di linfoma Burkitt convertite con il virus di Epstein Barr
Other Titles: Lipoxygenase and survival in Burkitt lymphomas tumoral cell lines converted to Epstein Barr virus
Authors: Belfiore, Maria Cristina
Keywords: Perossidi;Lipossigenasi;Acido idrossitetraenoico;Hydroxyeicosatetraenoic acid;Lipoxygenase;LOX;HETE;X-IAP;SMAC;BIO/18
Issue Date: 9-May-2006
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 18. ciclo
Abstract: 
Molte forme aggressive di linfomi B sono ancora scarsamente curabili e tra questi il linfoma di Burkitt, la cui insorgenza è fortemente associata all’infezione con il virus di Epstein Barr.
Alla base dell’assenza di una risposta ad un convenzionale trattamento chemioterapico vi sono alterazioni molecolari e genetiche che comportano resistenza all’apoptosi.
Nel nostro sistema cellulare di linfoma di Burkitt dopo infezione con il virus di Epstein Barr e l’instaurarsi della latenza sono stati ottenuti dei cloni EBV positivi (HS1, E2b ed E2R) caratterizzati da una maggiore resistenza a vari trattamenti apoptogeni e da una sovra-espressione della proteina antiapoptotica Bcl-2, in assenza della proteina latente di membrana LMP1.
I cloni EBV positivi presentano più alti livelli di perossidi endocellulari ed in maniera direttamente correlata alla resistenza all’apoptosi.
La ricerca che è stata condotta durante questi anni ha portato ad individuare l’attività enzimatica della 5-lipossigenasi come principale fonte che contribuisce al più alto stato ossidativo nei cloni EBV positivi: inibitori delle lipossigenasi ed in particolare della isoforma 5-LOX riducono infatti sensibilmente i livelli ossidativi e soprattutto nella linea EBV positiva E2R.
Da studi di espressione mediante RT-PCR è stato visto che la isoforma 5-lipossigenasi è maggiormente espressa nel clone EBV positivo E2R, seguita dalla isoforma 12-lipossigenasi mentre solo debolmente espressa risulta la isoforma 15-LOX2; la isoforma 15-LOX1 e le ciclossigenasi non sono invece affatto espresse.
E’stata altresì trovata mediate PCR quantitativa in Real-Time una chiara e diretta relazione tra l’espressione della isoforma 5-LOX ed i livelli di perossidi nei diversi cloni.
Gli inibitori specifici della isoforma 5-LOX (AA861, MK886, BWA4C) inducono fortemente in apoptosi la linea cellulare E2R; ciò indica che la 5-lipossigenasi interviene nel mediare segnali di sopravvivenza; è stato dimostrato che questa segnalazione procede tramite particolari metaboliti delle LOX, gli acidi idrossieicosatetraenoici (HETE) che proteggono le cellule della linea E2R dall’apoptosi indotta da inibizione lipossigenasica.
Inoltre sono state studiate le vie apoptotiche attraverso le quali si attua il processo di morte dopo inibizione della 5-LOX.
Si è potuto dimostrare che a fronte di un’attivazione costitutiva delle caspasi nei controlli l’apoptosi non procede poiché vi è un blocco sulle caspasi attive stesse operato dalla proteina antiapoptotica XIAP.
L’apoptosi nella linea cellulare E2R è accompagnata sempre da un rilascio mitocondriale molto precoce della proteina pro-apoptotica Smac, precedente al rilascio di citocromo c, e da una diminuzione di XIAP; infine solo l’inibizione della caspasi 3, e non l’inibizione delle caspasi 9 e 8, protegge le nostre cellule E2R dalla morte a dimostrazione del fatto che il processo è caspasi 3-dipendente quando il rilascio mitocondriale di Smac causa l’eliminazione del blocco operato da XIAP.
Alla luce di questi risultati è possibile ipotizzare dei nuovi protocolli chemioterapici che facciano uso sia di inibitori delle lipossigenasi, sia di farmaci con un’azione simile a Smac, in combinazione con altri trattamenti per sensibilizzare i linfomi all’apoptosi.
Infine il nostro sistema cellulare BL41 vs E2R è stato utilizzato per saggiare l’azione apoptogenica ed antiossidante di lignani ariltetralinici con una potenziale azione di inibitori della 5-LOX; interessante è stato notare che alcuni derivati di neosintesi sono fortemente citotossici sulla linea cellulare resistente E2R.

Numerous aggressive forms of B lymphomas are still poorly curable and among them the Burkitt Lymphoma, the oncet of which is strongly associated to Epstein-Barr virus (EBV) infection. Molecular and genetic alterations that confer apoptosis resistance are responsible for the lack of any response to a conventional chemotherapeutic treatment.
In a system of Burkitt lymphoma cell line after the EBV infection and the establishment the of the latent condition are obtained various EBV positive clones (HS1, E2b and E2R) characterized by major apoptosis resistance, over-expression of the antiapoptotic protein Bcl-2 in spite of the lack of any expression of the viral latent membrane protein LMP-1.
Moreover the different EBV positive clones show increased levels of cellular endogenous peroxides directly correlated to apoptosis resistance: interestingly a 5-lipoxygenase enzymatic activity seems to be the main source of oxidative stress and specific 5-LOX inhibitors significantly reduce the peroxide status.
Studies through RT-PCR show that in the EBV-converted E2R cell line 5-Lox gene is the mostly expressed followed by 12-Lox gene; the 15-Lox1 gene is only weakly expressed while the 15-Lox2 and cicloxygenase genes are not detected.
Moreover through quantitative PCR in Real-Time I have found an evident and direct correlation between 5-Lox gene expression and peroxides levels in the various clones.
Specific inhibitors of the 5-LOX isoform (AA861, MK886, BWA4C) induce in apoptosis the resistant cell line E2R showing that this enzyme take part in mediate survival signals.
I have seen that LOX signal transduction proceed through special LOX metabolites named hydroxyeicosatetraenoic acid or HETE.
In addition I have studied the apoptotic pathways through which the death program is realized after 5-LOX inhibition in E2R cell line.
In spite of a constitutive activation of caspases in the controls the death program is stopped by the action of the protein inhibitor of apoptosis X-IAP; so in the E2R the induction of apoptosis machinery is always accompanied by the mitochondrial release of the pro-apoptotic protein SMAC (second mitochondria-derived activator of caspases), preceding the release of cytochrome c, and by a decrement in X-IAP; moreover only the specific inhibition of caspase 3, but not the inhibition of caspases 8 and 9, saves the E2R cell line by the death (indicating that apoptotic program is caspase 3 dependent when the mitochondrial release of SMAC removes the block operates by X-IAP).
In the light of this research new chemotherapeutic approach can be hypothesized using LOX inhibitors and drugs mimicking SMAC, in combination with standard treatments, to increase lymphomas response.
Finally I have used the cellular system BL 41 vs E2R to test the apoptogenic and antioxidant action of aryltetralin lignans with a potential activity of 5-LOX inhibitors; interestingly some neo-synthetic derivatives are strongly apoptogenic on E2R resistant cell line (Saladino et al, Bioorganic & Medicinal Chemistry , 2005).
Description: 
Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellulare
URI: http://hdl.handle.net/2067/108
Rights: If not otherwise stated, this document is distributed by the Tuscia University Open Archive under a Creative Commons 2.0 Attribution - Noncommercial - Noderivs License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.0/)
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