Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/1049
Title: Anticorpi ricombinanti per la diagnostica agro-alimentare
Other Titles: Recombinant antibodies for uses in agro-food diagnostics
Authors: Catellani, Marcello
Keywords: Micotossine;Anticorpi ricombinanti;Ibridoma;Espressione transiente;Diagnostica agro-alimentare;Mycotoxins;Recombinant antibodies;Hybridoma;Transient expression;Agri-food diagnostics;BIO/11
Issue Date: 26-Feb-2010
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 22. ciclo
Abstract: 
Le micotossine sono metaboliti secondari prodotti da diversi funghi che appartengono principalmente a tre generi molto diffusi: Aspergillus, Penicillium e Fusarium. In particolare, l’aflatossina B1 è un contaminante molto comune che si può ritrovare in un’ampia gamma di prodotti alimentari. L’attenzione rivolta verso questi contaminanti è giustificata dai gravi effetti (teratogeni, cancerogeni, estrogeni, neurotossici e di immunosoppressione) sulla salute dell’uomo e degli animali conseguenti all’assunzione attraverso il cibo.
Una contaminazione da micotossine può avvenire in campo prima e/o durante il raccolto oppure nella successiva fase di conservazione e processamento delle derrate alimentari. Sebbene l’uso di fitofarmaci e buone pratiche colturali possano ridurre il rischio di contaminazioni, la completa eliminazione delle micotossine dai prodotti alimentari non è ad oggi realisticamente raggiungibile. Pertanto la diagnostica rimane uno strumento fondamentale per ridurre il rischio correlato all’assunzione di cibi contaminati. Scopo di questo lavoro è stato l’isolamento e la caratterizzazione di nuovi immuno-reagenti per la diagnostica agro-alimentare, ed in particolare anticorpi ricombinanti da esprimere in sistemi a basso costo alternativi al sistema classico di colture di cellule di mammifero.
Inizialmente si è tentato di isolare anticorpi, diretti al riconoscimento dell’aflatossina B1 e dell’ocratossina A, da due differenti repertori sintetici di anticorpi ad esposizione su fago (F8 ed ETH-2-Gold). E’ stata scelta questa metodologia di selezione in quanto risulta semplice, poco costosa ed ha consentito di operare la selezione su più antigeni contemporaneamente. Purtroppo da entrambi i repertori utilizzati non sono stati isolati anticorpi specifici per le tossine d’interesse. Pertanto, per isolare anticorpi specifici almeno per l’aflatossina B1, si è deciso di utilizzare il sistema classico di selezione da ibridomi murini. Topi Balb/c sono stati immunizzati con l’aflatossina B1 coniugata alla Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) come carrier proteico, questo per ovviare alla scarsa immunogenicità della tossina dovuta alle sue ridotte dimensioni (~300 Da). Dagli ibridomi ottenuti sono stati isolati tre differenti cloni cellulari secernenti anticorpi monoclonali in grado di riconoscere l’aflatossina B1 libera in soluzione in ELISA competitivo.
I geni codificanti le catene pesanti e leggere degli anticorpi sono stati amplificati dal cDNA dei tre ibridomi utilizzando oligonucleotidi degenerati (descritti in letteratura per la catena gamma - Wang et al., 2000 Journal of Immunological Methods 233: 167-177) e disegnando nuovi oligonucleotidi basati su sequenze note per la catena leggera lambda (Kabat et al., 1991; Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office). I geni delle catene leggere e pesanti sono stati quindi separatamente clonati in un vettore per l’espressione transiente in pianta mediata da A. tumefaciens (pBI) e piante di N. benthamiana sono state co-agroinfiltrate con entrambi i costrutti per ciascun clone (2D2_G1 e 9E11_D5). L’analisi western blot degli estratti di pianta ha mostrato alti livelli di espressione degli anticorpi, mentre il corretto assemblaggio e la funzionalità delle IgG murine è stata valutata mediante ELISA. Gli anticorpi, purificati dalle foglie infiltrate, hanno dimostrato di riconoscere in ELISA l’aflatossina B1 con la medesima specificità ed affinità dei rispettivi anticorpi purificati da terreno di crescita degli ibridomi murini.
Inoltre, le sequenze delle regioni variabili dell’anticorpo monoclonale 2D2_G1, sono state ingegnerizzate per ottenere due differenti formati ricombinanti dell’anticorpo: il scFv e il scFv-Fc. Il scFv(2D2_G1) è stato espresso in E. coli e dopo la purificazione la specificità dell’anticorpo per l’aflatossina B1 è stata valutata per ELISA ed analisi SPR (Surface Plasmon Resonance). In parallelo, il formato scFv-Fc è stato clonato in un vettore per l’espressione transiente in pianta mediata da A. tumefaciens (pBI) ed infiltrato in piante di N.
benthamiana. L’analisi western blot degli estratti di pianta e l’ELISA hanno confermato il corretto assemblaggio e la funzionalità di questo formato ricombinante dell’anticorpo.
In conclusione, sono stati isolati due differenti anticorpi monoclonali murini diretti al riconoscimento dell’aflatossina B1 ed i geni codificanti per gli anticorpi sono stati clonati ed ingegnerizzati. Tutti i formati anticorpali ricombinanti espressi in sistemi eterologhi hanno mantenuto la specificità per l’antigene dei mAb murini, rinforzando così l’idea delle piante come bioreattori efficienti ed economici per la produzione di IgG in alternativa ai sistemi classici di colture di cellule di mammifero, ed aprendo nuovi orizzonti applicativi nell’ambito della diagnostica agro-alimentare.

Mycotoxins are secondary metabolites produced by several fungi belonging mainly to the genera: Aspergillus, Penicillium and Fusarium. In particular, aflatoxin B1 is a common contaminant occuring in a wide range of important raw food commodities. Consumption of mycotoxin-contaminated food or feed eventually leads to teratogenic, cancerogenic, oestrogenic, neurotoxic, and immunosuppresive effects in humans and/or animals.
Mycotoxin contamination may occur in the field before and/or during harvesting, or in the storage and processing. Although the use of pesticides and good agronomic practices may reduce mycotoxin accumulation, eradication is still a major challenge. Therefore, diagnostics remains a fundamental tool to reduce risks associated to the assumption of contaminated food. To this aim, we concentrated our efforts on the isolation and characterization of new diagnostic immuno-reagents such as recombinant antibodies to be expressed in cost-effective systems as an alternative to classical mammalian cell culture system.
Initially, we attempted to isolate antibodies against aflatoxin B1 and ochratoxin A from two different synthetic antibody phage display libraries (F8 and ETH-2-Gold). In principle, this approach could represent a straightforward solution, as the methodology is simple, inexpensive, enabling simultaneous processing of several antigens. Unfortunatly, no antibody specific to these toxins were isolated from both libraries.Therefore, to isolate antibodies at least against aflatoxin B1, Balb/c mice were immunized with the toxin conjugated to the carrier Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH), due to the poorly immunogenic size of this molecule (~300 Da). Three different clones were isolated from hybridomas and all derived monoclonal antibodies were able to recognize free aflatoxin B1 in competitive ELISA.
The genes encoding the antibody heavy and light chains were amplified from the cDNA of the three hybridomas using a set of degenerated primers (as described in literature for the gamma chain - Wang et al., 2000 Journal of Immunological Methods 233: 167-177) and designing Kabat sequence-based primers for the lambda chain (Kabat et al., 1991; Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office). Light and heavy chain genes were separately cloned in an Agrobacterium-mediated plant expression vector (pBI) and N. benthamiana plants were co-agroinfiltrated with both constructs for each clone (2D2_G1 and 9E11_D5). Western blot analysis of plant extracts revealed high expression levels of antibody chains, while the correct assembly and functionality of murine IgGs was evaluated by ELISA. The antibodies, purified from infiltrated leaves, bind aflatoxin B1 to the same extent as the cognate antibodies purified from murine hybridomas in ELISA.
Moreover, starting from the variable regions sequences of mAb 2D2_G1, two different recombinant formats were engineered: the scFv and the scFv-Fc. The scFv(2D2_G1) was expressed in E. coli and after purification, antibody specificity to aflatoxin B1 was evaluated by ELISA and SPR (Surface Plasmon Resonance) analysis. In parallel, the scFv-Fc format was cloned in an Agrobacterium-mediated plant expression vector (pBI) and N. benthamiana plants infiltrated. Western blot analysis of plant extracts and ELISA confirmed the correct assembly and functionality of this recombinant antibody format.
In conclusion, two different murine monoclonal antibodies against aflatoxin B1 have been generated and corresponding antibody genes cloned and engineered. All recombinant antibody formats expressed in heterologous systems retain the specificity of the original mAbs reinforcing the idea that plants are convenient bioreactors for the production of IgG alternative to classical mammalian cell culture systems, thus opening new horizons for both agricultural and diagnostic applications.
Description: 
Dottorato di ricerca in Biotecnologie vegetali
URI: http://hdl.handle.net/2067/1049
Rights: If not otherwise stated, this document is distributed by the Tuscia University Open Archive under a Creative Commons 2.0 Attribution - Noncommercial - Noderivs License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.0/)
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