Zebrafish (Danio rerio): a model to study in-vivo and ex-vivo cardiac

Abstract

Despite continuing progress in medical therapies and in revascularization strategies at coronaries level, heart diseases remains a leading cause of mortality throughout industrialized countries. Mammals have an extremely limited capacity to repair damaged heart tissue after a myocardial infarction. Regeneration, the replacement of damaged or lost body parts, is a primary goal of stem cell research. In fact, during this process, differentiated cells reenter the cell cycle and proliferate to generate a mass of undifferentiated cells. Several vertebrates display different ability to regenerate organs and tissues, thus encouraging biologists to seek out models for heart regeneration. The robust capacity of zebrafish (Danio rerio) to regenerate a variety of tissues, position it as an ideal genetic model system for understanding the molecular and cellular events governing regeneration. Numerous works have shown that adult zebrafish can effectively regenerate in-vivo injured hearts submitted to partial surgical amputation of the ventricle area. In fact, during this process, new cardiomyocytes limit the scar formation and form new muscular tissue. However the molecular mechanisms that regulate this process remains unclear and resolving the genes, the microRNAs and the proteomic alterations that control these changes can illuminate how heart regeneration is naturally optimized. Activation of the regenerative potential of human tissue implicates a novel therapeutic approach to supplement, or replace, conventional pharmacotherapy and mechanical intervention. In this thesis, using qRT-PCR experiments, it was demonstrated that some microRNAs (miRNAs), as miR1 and miR-133, were down-regulated during the in-vivo regeneration of adult zebrafish hearts submitted to amputation of around 20% of the ventricle apex. Also, similar changing in microRNAs levels were observed during hypertrophic conditions induced ex-vivo. The adult zebrafish heart, containing numerous cardiac progenitors, resulted a good model to approach the general mechanisms of adult cardiac stem cell maintenance and cardiogenesis. Here, zebrafish was also used as model to test for a correlation between Fibroblast Growth factors (FGFs) signaling and cell proliferation in adult injured hearts. With In Situ Hybridization (ISH) experiments, here were reported the time and space expression of FGFs targets genes (erm, etv5, pea3, dusp6, sef sprouty4, and raldh2), involved in in-vivo heart regeneration. With the aim to optimize the media to reproduce the regeneration process, it was also tested the ability of zebrafish heart to survive in ex-vivo cultures after the amputation of ventricular apex. Regenerating hearts in ex-vivo conditions were able to survive 4 and make contractions, and surprisingly showed different degree of cell replication, incorporating BrdU, in dependence to the culture media. So far, there is no study regarding the proteomic aspect the heart regeneration in zebrafish. Proteomic offers an innovative approach to integrate the genomic study that alone is not sufficient to understand the all the cellular mechanisms. Here, for the fist time, it is reported a proteomic study of adult zebrafish heart, that allowed the identification of more than one hundred proteins, belonging to different biological classes as, enzymes, signal transduction, growth factors, cytoskeletal components, globin, and structural proteins. The identification of the proteins naturally expressed in the adult zebrafish heart is not only important as basic biological knowledge, but also, because it constitute a reference point to compare proteins expression during cardiac regeneration. In fact, applying innovative and sensible two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (DiGE), combined with MALDI-TOF/TOF tandem mass spectrometry, here it was possible to identify proteins differentially expressed at 3 days after amputation of around 20% of the ventricle area, compared with hearts not injured. Among more than one hundred proteins spots detected in 2D-gels, three (ATP synthase, hyaluronan mediated motility receptor, and desmuslin) were up-regulated in injured hearts. Information concerning the global alteration protein pattern during heart regeneration will be helpful for a better formulation of new diagnostic and therapeutic markers. Also, due to the similarities between the fish and mammalian genomes,this experimental system should also provide clues to understanding human pathophysiology and the new frontier of stem cell regeneration system.

Nonostante i continui progressi nelle terapie mediche e nelle strategie di rivascolarizzazione a livello delle coronarie, le malattie cardiache rimangono la principale causa di morte nei paesi industrializzati. I mammiferi mostrano una limitata capacità di riparare il tessuto cardiaco danneggiato dopo un infarto al miocardio. La rigenerazione, il rimpiazzo di parti corporee danneggiate o amputate, è l’obiettivo primario della ricerca sulle cellule staminali. Infatti, durante questo processo, cellule differenziate rientrano nel ciclo cellulare e proliferano per generare una massa di cellule indifferenziate. La capacità di rigenerare organi e tessuti varia ampiamente tra i vertebrati, incoraggiando i biologi a cercare modelli alternativi di rigenerazione cardiaca. La peculiare caratteristica del pesce zebra (Danio rerio) di rigenerare vari tessuti, lo ha promosso sistema modello genetico ideale per capire i meccanismi molecolari e cellulari alla base del processo rigenerativo. Numerosi lavori hanno dimostrato che il pesce zebra (o zebrafish) adulto può efficacemente rigenerare in-vivo il cuore soggetto a parziale amputazione del ventricolo. Durante questo processo, infatti, i cardiomiociti, stimolati a replicare da numerosi fattori di crescita, rimpiazzano la cicatrice con nuovo tessuto muscolare. Tuttavia, i meccanismi molecolari che regolano la rigenerazione rimangono poco chiari e, caratterizzare i geni, i microRNA e le alterazioni proteomiche che controllano questi cambiamenti, può offrire dati importanti su come la rigenerazione cardiaca sia naturalmente ottimizzata. L’attivazione del potenziale rigenerativo del tessuto umano comporterebbe un approccio terapeutico innovativo per supplementare o,addirittura rimpiazzare la farmacoterapia convenzionale e l’intervento meccanico. In questo lavoro di tesi, attraverso esperimenti di qRT-PCR, è stato possibile dimostrare che alcuni microRNA (miRNA), quali miR1 e miR133, vengono down-regolati durante la rigenerazione in-vivo del cuore adulto di zebrafish, sottoposto ad amputazione di circa il 20% dell’apice ventricolare. Inoltre, simili variazioni dei livelli dei microRNA sono state osservate durante condizioni d’ipertrofia indotte ex-vivo. Il cuore di zebrafish adulto,contenendo numerosi progenitori cardiaci, è risultato un modello vantaggioso per capire i meccanismi che regolano il mantenimento delle cellule staminali adulte e la cardiogenesi. In questo lavoro, il pesce zebra è stato utilizzato anche come modello per testare l’esistenza di una correlazione tra la segnalazione dei Fattori di Crescita dei Fibroblasti (FGF) e la proliferazione cellulare nei cuori adulti operati. Attraverso esperimenti di Ibridazione In Situ (ISH), sono state studiate le espressioni nel tempo e nello spazio di geni target degli FGF 6 (erm, etv5, pea3, dusp6, sef sprouty4, and raldh2), implicati nella rigenerazione cardiaca. Con lo scopo di ottimizzare il mezzo di coltura per riprodurre il processo rigenerativo, è stata inoltre testate la capacità dello zebrafish di sopravvivere in colture ex-vivo, dopo l’amputazioe dell’apice ventricolare. I cuori lasciati rigenerare in colture ex-vivo sono stati in grado di sopravvivere e di emettere contrazioni e, sorprendentemente, hanno mostrato diversi gradi di replicazione cellulare, incorporando BrdU, in dipendenza al terreno di coltura. Ad oggi, non sono presenti studi riguardanti l’aspetto proteomico della rigenerazione cardiaca in zebrafish. La proteomica offre un approccio innovativo per integrare lo studio genomico che da solo non è sufficiente per comprendere tutti i meccanismi cellulari. In questo studio, per la prima volta, è stato applicato un approccio proteomico per lo studio del cuore di zebrafish adulto. Ciò ha permesso l’identificazione di oltre cento proteine, appartenenti a diverse classi biologiche quali, enzimi, trasduttori di segnale, fattori di crescita, componenti citoscheletrici, globine e proteine strutturali. L’identificazione di proteine naturalmente espresse nel cuore di zebrafish adulto, non solo rappresenta un’importante conoscenza biologica di base, ma costituisce inoltre un punto di riferimento per il confronto delle espressioni proteiche durante la rigenerazione cardiaca. Infatti, in questo studio, applicando l’innovativa e sensibile tecnologia di elettroforesi bidimensionale differenziale (DiGE), combinata con spettrometria di massa tandem MALDI-TOF/TOF, e’ stato possibile identificare proteine diversamente espresse a 3 giorni dopo l’amputazione di circa il 20% dell’area ventricolare, rispetto a cuori di controllo non operati. Tra i più di cento spot proteici osservati con gel 2D, tre (ATP sintasi, recettore di motilità mediata da ialurone, e desmuslina), sono risultati up-regolati nei cuori in rigenerazione. Le informazioni riguardanti le alterazioni proteiche globali durante la rigenerazione cardiaca saranno utili per migliorare la formulazione di nuovi farmaci e marcatori terapeutici. Inoltre, data la forte somiglianza del genoma tra pesce e uomo, questo sistema sperimentale potrebbe offrire informazioni utili per capire le malattie umane e offrire nuove opportunità di rigenerazione mediante l’utilizzo di cellule staminali.