Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/1023
Title: Improving the nutrient composition of Chlamydomonas reinhardtii to enhance the production of photosynthetic active metabolites: a molecular study on the Photosystem II complex
Other Titles: Arricchimento della componente nutritiva in Chlamydomonas reinhardtii attraverso l’accumulo di metaboliti fotosintetici attivi: uno studio molecolare sul Fotosistema II
Authors: Antonacci, Amina
Keywords: Chlamydomonas reinhardtii;Photosynthetic metabolites;Photosystem II;Metaboliti fotosintetici;Fotosistema II;BIO/04
Issue Date: 26-Feb-2010
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 22. ciclo
Abstract: 
This thesis has been supported by the Nutra-Snack project, aimed to the production of “Ready to eat food for breakfast and sport activity with high content of nutraceutics reducing disease risk and promoting public health”. In this context, the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii has been used to characterize particular features of the photosynthetic process and to test its capability to over-produce photosynthesis-derived pigments, to be used as supplements in healthy diets. Nowadays, photosynthesis-derived pigments, such as carotenes and xantophylls, are of great interest for health and human nutrition; they are normally synthesized by several bacteria, algae and plants, but not by humans that should take them from the diet.
In particular, we exploited chlamydomonas strains carrying mutation in the D1 protein and in Non Photochemical Quenching (NPQ) process, and their relative wild types. According to the literature, the physiological characterization of the NPQ mutants revealed no important differences between mutants and wild type concerning the photosynthetic parameters, such as oxygen evolution and photosynthetic efficiency. On the contrary, the physiological characterization of D1 mutants revealed a remarkably reduction of the electron transfer efficiency between the primary (QA) and the secondary (QB) quinone acceptors in photosystem II (PSII), and a lower oxygen evolution capacity compared to the reference strain. In addition, the D1 mutants displayed a different Chla/cell ratio compared to the reference strains, which is indicative of a reduced peripheral antenna cross section, hence of a reduced light absorption capacity. Also the photosynthetic pigment quantification was different among D1 strains, mainly in the content of the total xanthophylls, e.g. violaxanthin, anteraxanthin, zeaxanthin and lutein, which are located in the peripheral antennae proteins. These evidences suggested that a single aminoacid substitution in the D1 protein located in the QB binding site could affect the overall PSII molecular structure. Molecular dynamic simulations could help to clarify this issue.
Comparison of the pigment profiles of all the analysed strains showed a notably higher pigments content in the NPQ compared to the D1 strains, indicating possible good candidate for biological farms developing.
In order to enhance the content of antioxidant photosynthetic pigments in C. reinhardtii D1 cultures, we applied high light and high temperature conditions and carried out time course analyses over a 90 minutes period. This treatment determined a strong reduction in photosynthetic efficiency, without affecting the total chlorophyll content in all the analysed D1 strains. Pigment profile highlighted the noteworthy response of the reference strain in comparison with mutants. In fact, a higher lutein and zeaxanthin accumulation in reference strain was observed, as well as the activation of xanthophylls cycle.
Real-time RT-PCR analyses on these samples were also performed on 11 genes involved in the biosynthesis of carotenoids, plastoquinones synthesis, D1 and D2 PSII reaction centre proteins. Time course analyses suggested that the first algal necessity in stressful condition was the induction of carotenoids biosynthesis genes, and that these data strongly correlated to pigment profile. Subsequently, also the plastoquinone genes were induced, probably because the requirement of oxidised PQ synthesis is important not only for the electron transport, but also for the activity of some enzymes involved in the initial carotenoids biosynthetic pathway.
In order to exploit the unicellular microalgae as natural source for valuable compounds, a second set of elicitation experiments was performed on the reference strain of D1 strains and included also the NPQ double mutant, which accumulates very high levels of zeaxanthin as a consequence of its mutation. In this way, we attempted to achieve bigger accumulation of antioxidant compounds in a shorter time, using very extreme high light and high temperature conditions (2000 µmol of photons/m2/s and 50°C). The ontained results showed that the reference strain of D1 set is the most responsive to the stress, for its rapidly capability to modulate its metabolism for zeaxanthin production. Instead, the NPQ double mutant accumulated a major zeaxanthin and β-carotene content, but it was less susceptible to metabolism modification. It is possible that xanthophylls accumulation levels exceeding a particular threshold could became dangerous for the cells that as a consequence, regulates its biosynthesis. As a whole these data indicated that the NPQ double mutant was the best producer of antioxidants pigments. However, the identification and characterization of the reference strain of D1 mutants revealed a genotype having a very flexible metabolism that is a desiderable culture threat for any nutraceutical application.
Future work will be dedicated to further clarify the involvement of PQ redox state in carotenogenesis pathway. In addition, taking into consideration the relevance of the lipid environment in the light and heat stress response, we will determine the lipid profile of different chlamydomonas mutants in these stressful conditions, in order to highlight and correlate structural and compositional modifications to the tolerance mechanisms.
For nutraceutical purposes, chlamydomonas growth conditions will be set up for large scale production of biomass with high nutraceutics content, and a safe protocol extraction will be developed. In addition, as C. reinhardtii belongs to the category of organism having a GRAS status (Generally Regarded As Safe, granted by Food and Drug Administration), a feasibility study will be carried out in an attempt to use it directly as food ingredient, obviously only after application of EU directives on novel food.

L’attività di questo dottorato di ricerca è stata supportata dal progetto Europeo Nutra-Snack, con l’intento di studiare ed immettere sul mercato nuovi prodotti alimentari, contenenti livelli bilanciati di lipidi, carboidrati e proteine, e composti nutraceutici di origine vegetale, noti per i loro benefici effetti sulla salute umana. Tra questi sono inclusi carotenoidi, chinoni, flavonoidi, polifenoli ed allicine, caratterizzati da una riconosciuta attività antiossidante, antibatterica, antinfiammatoria, anticancerogena e antilipidemica. Il progetto, che prevedeva un’ampia attività di ricerca di base, ha consentito di effettuare uno studio sulle proprietà del fotosistema II (PSII) di diversi ceppi dell’alga unicellulare Chlamydomonas reinhardtii che è stata, quindi, utilizzata sia come sistema modello per studi sulla fotosintesi che come possibile produttore di composti antiossidanti di origine fotosintetica. Tali metaboliti, infatti, sono sintetizzati da batteri fotosintetici, alghe e piante, ma non dall’uomo, che per tale ragione deve necessariamente assimilarli attraverso la dieta. La possibilità, quindi, di ottenere elevati livelli di tali composti in modo rapido e mediante un sistema naturale si è rivelato di grande interesse.
La presente attività di ricerca ha messo a confronto due ceppi di chlamydomonas recanti mutazioni puntiformi nella proteina D1 del centro fotosintetico con il relativo genotipo di riferimento; e tre mutanti nel processo di Non Photochemical Quenching (NPQ), difettivi in due enzimi diversi implicati nella via biosintetica dei carotenoidi, con il relativo genotipo selvatico. Come conseguenza delle mutazioni, i mutanti NPQ accumulano elevati livelli dei pigmenti fotoprotettivi. In relazione alla capacità di produrre metaboliti di interesse nutraceutico, le due serie di mutanti sono stati confrontati anche tra loro. La caratterizzazione dei mutanti NPQ è ben nota, ed alcuni dei parametri fisiologici da noi determinati correlano con quanto riportato in letteratura. A parte la dimensione delle proteine antenna cattura della luce, efficienza fotosintetica ed evoluzione di ossigeno non sono particolarmente diverse tra genotipo selvatico e mutanti.
Per quanto riguarda le analisi effettuate sulla serie dei mutanti D1, è stato evidenziato che una sola modificazione aminoacidica è in grado di determinare profondi cambiamenti funzionali sull’apparato fotosintetico ed in misura diversa a seconda della posizione dell’aminoacido sostituito. In particolare, i mutanti analizzati hanno mostrato una ridotta efficienza fotosintetica dovuta ad un accumulo di plastochinone ridotto, QA-, quindi un rallentamento del trasporto elettronico. Questo fenomeno potrebbe spiegare anche la minore capacità di evolvere ossigeno che è stata osservata in questi ceppi. Inoltre, sia il profilo che il contenuto dei pigmenti fotosintetici si è rivelato inferiore nei mutanti rispetto al genotipo di riferimento, in particolare per quanto riguarda le xantofille, zeaxantina, anteraxantina, violaxantina e luteina, e questa osservazione correla perfettamente con le ridotte dimensioni dei complessi antenna cattura luce riscontrate nei mutanti. Questi risultati hanno portato ad ipotizzare che la singola mutazione nella proteina D1 possa determinare modificazioni strutturali nella proteina che si riflettono in cambiamenti nell’architettura del PSII. Si è quindi, proceduto alla caratterizzazione del processo fotochimico nei mutanti D1 in condizioni di luce e temperature elevate. Tale trattamento aveva anche il fine di implementare l’accumulo di pigmenti fotoprotettivi ad attività antiossidante, la cui sintesi è noto essere indotta in queste condizioni. A tal fine, i ceppi D1 di C. reinhardtii sono stati sottoposti ad intensità di luce di 1000 mmoli/m2/s e temperatura di 37°C per 90 minuti, ed analizzati ad intervalli di tempo regolari. Tale trattamento ha causato in tutti i ceppi analizzati una forte riduzione dell’efficienza fotosintetica, senza tuttavia alterare il contenuto totale di clorofille, quindi la struttura del PSII. La quantificazione dei pigmenti ha evidenziato nel ceppo di riferimento, piuttosto che nei mutanti, un forte incremento nei livelli di accumulo di luteina e l’attivazione del ciclo delle xantofille che ha determinato un aumento dei livelli di accumulo di zeaxantina. Nei mutanti i livelli indotti di carotenoidi non sono risultati maggiori di quelli presenti nel ceppo di riferimento.
Abbiamo, quindi, effettuato esperimenti di real-time RT-PCR per studiare i meccanismi di regolazione che operano in risposta al trattamento con alta luce ed alta temperatura. Sono stati analizzati undici geni: sette coinvolti nella biosintesi dei carotenoidi, due in quella del plastoquinone (PQ) e due per la codifica delle proteine D1 e D2 del centro di reazione del PSII. Tale studio ha mostrato che nelle fasi precoci di stress le colture algali compensano il bisogno di pigmenti fotoprotettivi inducendo fortemente i geni della via biosintetica dei carotenoidi. Successivamente, vengono indotti i geni implicati nella via biosintetica del plastochinone, probabilmente per soddisfare la necessità di PQ ossidato indispensabile, non solo per sostenere il trasporto elettronico, ma anche per l’attività di enzimi coinvolti nelle prime reazioni della biosintesi dei carotenoidi. L’accumulo dei pigmenti e dei livelli dei relativi geni biosintetici correla temporalmente nei ceppi analizzati.
Per fini nutraceutici, e tenuto conto dell’innovativo impiego di microalghe unicellulari come fonte naturale di composti funzionali per la salute dell’uomo, una seconda serie di esperimenti di elicitazione è stata effettuata sui due genotipi di riferimento e sul doppio mutante della serie NPQ, che accumula naturalmente elevati livelli di zeaxantina. L’obiettivo finale era di implementare ulteriormente i livelli di accumulo delle xantofille, e ridurre possibilmente i tempi di esposizione allo stress. Sono state, quindi, utilizzate condizioni estreme sia di luce che di temperatura: 2000 mmoli/m2/s e 50°C. I risultati ottenuti hanno evidenziato che in assoluto il doppio mutante presenta i livelli più elevati dei pigmenti antiossidanti b-carotene e zeaxantina, risultando, quindi il miglior produttore. Tuttavia, il genotipo di riferimento della serie dei mutanti D1 è risultato il più prono all’induzione dei meccanismi di difesa, essendo in grado di elevare di 20 volte i livelli di accumulo di zeaxantina. La suscettibilità alla modulazione è un prerequisito fondamentale per ogni ceppo impiegato in applicazioni nutraceutiche, ed è per questo motivo che tale ceppo rappresenta un importante punto di riferimento per i nostri studi.
Le attività future prevedranno i) studi volti a chiarire il coinvolgimento dello stato redox del PQ nella biosintesi dei carotenoidi; ii) l’ottimizzazione di protocolli per la produzione su larga scala di biomasse ad alto contenuto nutraceutico e iii) l’ottimizzazione di metodi di estrazione sicuri per la salute dell’uomo, dei metaboliti di interesse. Infine, considerando che C. reinhardtii appartiene alla categoria di organismi aventi stato GRAS (Generally Regarded As Safe, determinato dalla Food and Drug Administration), si procederà ad effettuare uno studio di fattibilità per l’impiego di tale alga direttamente come ingrediente alimentare, seguendo le procedure indicate dalla Comunità Europea per la produzione di novel food.
Description: 
Dottorato di ricerca in Biotecnologie vegetali
URI: http://hdl.handle.net/2067/1023
Rights: If not otherwise stated, this document is distributed by the Tuscia University Open Archive under a Creative Commons 2.0 Attribution - Noncommercial - Noderivs License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.0/)
Appears in Collections:Archivio delle tesi di dottorato di ricerca

Files in This Item:
File Description SizeFormat
aantonacci_tesid.pdf2.88 MBAdobe PDFView/Open
Show full item record

Page view(s)

1
Last Week
1
Last month
0
checked on Oct 29, 2020

Download(s)

1
checked on Oct 29, 2020

Google ScholarTM

Check


This item is licensed under a Creative Commons License Creative Commons