Model and real wines detoxification by free and immobilised acid urease in stirred bioreactors

Abstract

This PhD thesis research project was aimed at selecting the most appropriate immobilisation carrier (i.e., Eupergit® C 250 L and chitosan beads, named Chitopearls BCW-3001, BCW-3003, BCW-3010, and HP-3020) for acid urease in terms of the specific activity of immobilised enzyme under different operating conditions, such as immobilization time, enzyme- or activating reagent-to-carrier ratios, pH of the immobilization buffer, and storage stability for as long as 30-170 days. The performance of immobilised acid urease in model wine solutions with or without grape seed tannins and real wines was assessed in bench-top scale stirred bioreactors and mathematically described by resorting to a conventional diffusion-reaction model. In particular, at the optimal glutaraldehyde-to-chitosan bead ratio (YGA/CHI) of 0.625 g g-1 , the specific activity (ABi) of acid urease immobilised covalently onto porous chitosan beads decreased from circa 300 to 70 IU g-1 wet support as the bead average diameter (dP) increased from 0.14 to 2.2 mm. Generally, ABi reduced less than 5% after preservation in the wet form at 4°C for 150-170 days. Only the biocatalyst prepared using the Chitopearl BCW-3001 lost about 40% of its initial activity. The activity of acid urease immobilised onto Eupergit® C 250L was smaller (19±3 IU g-1 ws) and unstable. In fact, in the same storage conditions ABi reduced to 68±15% of the initial activity after about 34 days. The kinetics of urea degradation in the model wines using these biocatalysts was of the pseudo-first order with respect to the urea concentration in the liquid bulk, the apparent pseudo-first order kinetic rate constant (kIi) ranging from about two thirds to one fifth of that (kIf) pertaining to free acid urease. In the operating conditions tested, the reaction kinetics was estimated as unaffected by the contribution of the external film and intraparticle diffusion mass transfer resistances. When the model wine solution was enriched with the high-inhibitory tannins extracted from grape seeds, at the maximum level tested (374±2 g GAE m-3) kIi reduced to no more than (58±9)% of kIf, this proving quite a higher protective action against such compounds for the chitosan-based biocatalysts towards free or Eupergit(R) C 250 L-immobilised acid urease.The kinetics of urea degradation in two target Italian white (i.e., Grechetto and Sauvignon Blanc) wines by using acid urease immobilised onto Eupergit® C 250 L or glutaraldehyde-crosslinked chitosan-derivatives beads (that is, Chitopearls BCW-3003 and BCW-3010), was confirmed to be of the pseudo-first order with respect to the urea concentration in the liquid bulk, and not limited by urea mass transfer. In Grechetto and Sauvignon Blanc wines the apparent pseudo-first order kinetic rate constants, when using Eupergit® C 250 L-, BCW-3003- or BCW-3010-based biocatalyst, were quite similar, even if they reduced to about 7, 18 or 17% of that observed for free enzyme in the model wine solution, respectively.The chitosan-based biocatalysts resulted to be more than twice less sensitive to the phenolic content of the wines tested than the Eupergit® C 250 L-based ones, this making the former potentially employable in the make up of packed-bed cartridges to remove continuously urea from commercial wines.

Questa tesi di dottorato ha riguardato la selezione del supporto commerciale più appropriato (Eupergit® C 250 L e sferette di chitosano, denominate Chitopearls) per immobilizzare ureasi acida valutando l’attività specifica dell’enzima immobilizzato al variare di diversi parametri operativi, come il tempo d’immobilizzazione, i rapporti enzima:supporto (YP/B) e reagente attivante:supporto (YGA/CHI), il pH del tampone d’immobilizzazione e la stabilità operativa per 30 o 170 giorni. La cinetica d’idrolisi dell’urea tramite i biocatalizzatori così ottenuti è stata determinata sia in soluzioni modello con o senza polifenoli estratti da vinaccioli, sia in vini reali in bioreattori ad agitazione meccanica da banco, descrivendola con il modello convenzionale di diffusione-reazione. In particolare, in corrispondenza del rapporto ottimale GA/CHI=0.625 g g-1 , l’attività specifica (ABi) dell’ureasi acida immobilizzata covalentemente sulle Chitopearls decresceva da circa 300 a circa 70 IU g-1 di supporto umido (ws) all’aumentare del diametro medio (dP) della particelle di supporto da 0,14 a 2,2 mm. Per i biocatalizzatori conservati in soluzione acquosa a 4°C ABi si riduceva meno del 5% dopo 150-170 giorni. Solo il biocatalizzatore a base di Chitopearl BCW-3001 perdeva circa il 40% dell’attività iniziale. Per contro, l’attività ureasica del biocatalizzatore a base di Eupergit® C 250 L risultava non solo nettamente inferiore (19±3 IU g-1 ws), ma anche più instabile, in quanto nelle medesime condizioni di conservazione adottate per i biocatalizzatori immobilizzati su Chitopearls l’attività si riduceva al 68±15% di quella iniziale dopo appena 34 giorni.La cinetica d’idrolisi dell’urea nelle soluzioni di vino modello promossa da tutti i biocatalizzatori in esame è stata descritta con un modello di pseudo-primo ordine rispetto alla concentrazione di urea nel mezzo di reazione e da un costante cinetica apparente di pseudo-primo ordine (kIi) pari al 66-20% di quella dell’enzima libero (kIf). Nelle condizioni operative esaminate, la cinetica di reazione non era limitata dalle resistenze al trasferimento di materia all’esterno e all’interno del biocatalizzatore.In presenza di tannini estratti da vinaccioli (374±2 g GAE m-3), kIi si riduceva al (58±9)% di kIf e ciò dimostrava che i biocatalizzatori immobilizzati su chitosano esercitavano una migliore azione protettiva nei confronti di questi polifenoli rispetto all’enzima sia libero che immobilizzato su Eupergit C 250 L. La cinetica di idrolisi dell’urea nei due vini bianchi italiani prescelti (Grechetto e Sauvignon Blanc) in presenza di ureasi acida, immobilizzata su Eupergit® C 250 L o su chitosano pre-attivato con gluteraldeide (Chitopearls BCW-3003 e BCW-3010), era anche essa descritta tramite un modello di pseudo-primo ordine rispetto alla concentrazione di urea ed anche in questo caso non era limitata dalle resistenze al trasporto di urea nel film esterno e all’interno del biocatalizzatore . Nei vini Grechetto e Sauvignon Blanc, la costante cinetica apparente di pseudo-primo ordine relativa ai biocatalizzatori immobilizzati su Eupergit® C 250 L-, BCW-3003- o BCW-3010 era abbastanza simile, anche se si riduceva rispettivamente al 7, 18 o 17% del valore relativo all’enzima libero in vino modello. I biocatalizzatori immobilizzati su chitosano sono risultati almeno due volte meno sensibili alla frazione polifenolica presente nei vini esaminati rispetto all’ureasi immobilizzata su Eupergit® C 250 L, il che permetterebbe di impiegarli per realizzare reattori a colonna impaccata per la detossificazione in continuo di vini chiarificati.