lmmunomodulazione dell'infezione virale da CMV in piante transgeniche di pomodoro

Abstract

L'immunomodulazione, mediata dall'espressione ectopica di anticorpi intracellulari ('intrabodies'), permette di interferire con funzioni patologiche o fisiologfiche in vivo in maniera specifica. Uno dei principali ostacoli di questa tecnologia è che la maggior parte degli anticorpi non assumono un corretto ripiegamento nell'ambiente riducente del citoplasma che previene la formazione di ponti disolfuro. Attualmente solo un piccolo numero di scFv sono stati espressi nel citoplasma in maniera funzionale. Tra questi vi è il scFv contro il virus dell'arricciamento maculato del carciofo (AMCV), scFv(F8); da questo anticorpo ricombinante, utilizzando la sua struttura stabile, è stato costruito un repertorio molecolare di frammenti anticorpali, tutti dotati di elevata stabilità intrinseca e solubili nell'ambiente riducente del citoplasma ('libreria F8') (Desiderio et al., 200 l). Questa libreria è stato il punto di partenza per il lavoro di dottorato ed è stata usata per isolare anticorpi contro il virus del mosaico del cetriolo (Cucumber Mosaic Virus, CMV). Dopo selezione ('biopanning') in vitro contro i virioni immobilizzati, sono stati selezionati due anticorpi (scFvG4 e scFvB4) specifici per la proteina di rivestimento virale. Questi anticorpi ricombinanti sono stati caratterizzati biochimicamente per Western blot, co-immunoprecipitazione e risonanza plasmonica di superficie, mostrando alta affinità e specificità per l'antigene. Inizialmente ambedue gli anticorpi sono stati espressi in maniera transiente, ad alti livelli e come molecole solubili, nel citoplasma di Nicotiana benthamiana. Questo primo esperimento ha permesso di dimostrare il corretto ripiegamento delle molecole ricombinanti all'interno della cellula vegetale e di costruire successivamente piante transgeniche di pomodoro (Micro Tom Meissner et al., 1997) che esprimono ambedue gli anticorpi ricombinanti nel citoplasma. Le linee transgeniche ottenute sono state selezionate per i livelli di espressione dell'anticorpo ricombinante e quelle con i livelli più alti sono state sfidate con il virus. La sfida con alte dosi virali è stata realizzata inizialmente con la generazione transgenica T2 e successivamente con quella T3. Ambedue gli anticorpi ricombinanti sono stati in grado di elicitare una risposta fenotipica e in particolare si è identificata una linea completamente resistente all'infezione virale. In queste piante il scFv si lega al virus nelle foglie inoculate (come dimostrato da esperimenti di co-immunoprecipitazione) prevenendo il movimento viraie a lunga distanza. E' stato dimostrata, infatti, sia mediante test ELISA che mediante biosaggio, la completa assenza del virus nelle foglie sistemiche delle piante transgeniche resistenti. Inoltre sono stati identificati tre diversi fenotipi, Resistente (R), Suscettibile (S) e Tollerante (T). Questi ultimi, inizialmente mostrano i sintomi in seguito ad infezione virale, ma sono poi in grado di riprendersi e formare frutti e semi regolarmente. I diversi fenotipi osservati sono strettamente correlati con i livelli di espressione del transgene. Questo lavoro, oltre ad aver permesso di ottenere delle piante di pomodoro completamente resistenti all'infezione virale da CMV, è anche la dimostrazione che la libreria F8 può essere selezionata in vitro per isolare rapidamente scFvs specifici che agiscono come anticorpi intracellulari in vivo.

Immunomodulation by the ectopic expression of intracellular antibodies ('intrabodies') has a great potential for interfering with physiological or pathological functions in vivo in a highly specific manner. One of the major obstacles of this technology is the inability of most antibodies to property fold and function in the reducing environment of the cytoplasm, which prevents the formation ofessential disulfide bonds. In our laboratory an antibody phage display library has been built on the scaffold of a single-chain variable fragment (scFv) previously proven to be functionally expressed in the reducing environment of both bacterial and plant cytoplasm and endowed with intrinsic high thermodynamic stability. This antibody library (named 'F8 library') allowed the isolation of new intrinsically stable antibodies expressed as soluble molecules in the bacterial cytoplasm and with new specificity (Desiderio et al., 2001), even though none were to be used as intracellular antibodies. This library has been the starting point for my Ph.D. thesis. We wished to assess the intracellular performance of antibodies derived from the 'F8 library'. To this purpose we chose to modulate the infection of a pandemic plant pathogen, the cucumber mosaic virus (CMV). After in vitro 'biopanning' on immobilized virions, two scFvs were isolated and biochemically characterized, showing high affinity toward the antigen. They were transiently expressed at high yields as soluble molecules in the cytoplasm of N-ic.otiana benthamiana plants. Subsequently, they were expressed in the cytoplasm of transgenic tornato plants (cv.Micro-Tom, Meissner et al., 1997). Challenge with high viraI dose showed that both scFvs were able to elicit a phenotypic effect and led to the identification of a transgenic line fully resistant to infection, showing that both scFvs when expressed in transgenic plants behave as intrabodies, accumulating as soluble proteins in the plant cytoplasm and have the ability to affect the plant phenotype upon virus challenge. Co-immunoprecipitation of the scFv-CMV complex from inoculated leaves of transgenic plants proves the occurrence of an in vivo interaction. This result suggests that, most likely, the scFv exert its in vivo modulation by restraining the infection into the inoculated leaves and impairing some other fundamental functions of CP, preventing CMV from moving long distance. This is further confirmed by a recovery test that demonstrates the complete absence of the virus in the apical leaves. In conclusion, we have shown that from our single-framework antibody repertoire, after classical in vitro screening, we isolated active intrabodies against a plant virus that conferred a new agronomic trait. Our library, containing stable scFvs able to modulate specific function in vivo, should automatically ensure that the isolated antibodies do bind their cognate antigens in the reducing environment of the cytoplasm, without having to recourse to further protein engineering andl or complicated selection procedures. F8 library-derived antibodies can also find application in functional genomics studies and, in the long run, might even be used in human therapy applications.