Analisi dei meccanismi di mantenimento dei telomeri in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

I telomeri sono un complesso nucleoproteico localizzato alle estremità dei cromosomi lineari eucariotici, costituiti da sequenze ripetute ricche in G sul filamento orientato 5’-3’. In S. cerevisiae questa regione comprende circa 350 bp di ripetizioni di DNA caratterizzate da un motivo comunemente abbreviato in C1-3A/TG1-3, mentre in tutti i vertebrati, compreso l’uomo, le sequenze telomeriche sono indicate con il motivo C3TA2/T2AG3. Oltre questa regione si estende una porzione di DNA a singolo filamento che sporge al 3’ detta G-Tail (Larrivee et al., 2004). La completa replicazione delle estremità cromosomiche avviene a seguito dell’azione di una specifica trascrittasi inversa chiamata telomerasi (Greider e Blackburn, 1985). L’attività della telomerasi è essenziale per mantenere un numero appropriato di ripetizioni in modo da contrastare la continua erosione dei telomeri osservata nelle cellule prive di quest’enzima. La perdita di un numero critico di ripetizioni di DNA telomerico conduce all’arresto del ciclo cellulare, mediato dai checkpoint di danno al DNA (DNA Damage Checkpoint-DDC) con importanti implicazioni per la stabilità ed il mantenimento dei cromosomi in molti eucarioti compreso l’uomo. A garantire l’integrità del telomero e la funzionalità della telomerasi, collaborano numerosi fattori con un elevato grado di conservazione tra uomo e lievito. Infatti, proteine specie specifiche che legano il DNA telomerico a doppio filamento (scRap1, hRap1, TRF1, TRF2) sono in grado di regolare la lunghezza del telomero sia in lievito che nell’uomo (Lundblad, 2000; deLange, 2002). La proteina hPOT1, che ha un elevata affinità per il DNA telomerico a singolo filamento, ha il suo analogo funzionale nella proteina di S. cerevisiae Cdc13 (Lundblad, 2003). Poiché la struttura e l’organizzazione del telomero, è essenzialmente conservata tra uomo e lievito, è possibile studiare i telomeri umani in un sistema modello come S. cerevisiae. A questo scopo è stato utilizzato un ceppo di lievito con una telomerasi modificata che aggiungere ripetizioni tipiche di mammifero (T2AG3) al posto di quelle di lievito (TG1-3). Questo ceppo è stato ottenuto sostituendo il gene TLC1, che codifica per la componente ad RNA della telomerasi, con l’allele tlc1-h. I ceppi tlc1-h, definiti “umanizzati” (Humanized Yeast – HY), sono vitali ed hanno telomeri stabili anche se più corti rispetto al ceppo selvatico (Hanning et al., 1998). Utilizzando come modello un lievito con telomerasi “umanizzata”, abbiamo recentemente dimostrato che questi ceppi soffrono dell’ attivazione cronica del checkpoint di danno al DNA Rad53, tale attivazione è associata ad un ritardo nel ciclo cellulare in G2. In aggiunta, abbiamo osservato che in assenza dei geni TEL1/ATM o MEC1/ATR, che fanno parte della famiglia delle chinasi PIKK (phosphatidylinositol 3- kinase-related kinases), la formazione di fusioni telomeriche. La formazione di queste fusioni correla con una riduzione della vitalità cellulare ed un elevato tasso di instabilità genomica. L’osservazione che nei ceppi HY è presente una coda telomerica a singolo filamento più lunga rispetto al ceppo selvatico, lascia ipotizzare che questa regione possa essere l’innesco per l’attivazione della cascata di segnalazione del danno Rad53-dipendente. La fosforilazione di Rad53 nei ceppi HY è presente fin dalle generazioni più precoci, tuttavia si è visto che soltanto quando vengono rimossi i checkpoint legati alla sorveglianza del danno al DNA quali Tel1, Mec1 ma anche Rad9, Rad17 è possibile osservare la formazione di fusioni telomeriche. Il clonaggio ed il successivo sequenziamento delle fusioni, ha permesso di individuarne la struttura e di riconoscere i cromosomi coinvolti. Dall’analisi dei risultati è emerso che l’elemento comune a tutti i cromosomi che sono andati incontro a fusioni è l’estrema corrosione della regione telomerica terminale, ad indicare che in assenza dei checkpoint di danno al DNA si accumulano un certo numero cromosomi con telomeri eccessivamente corti che vanno incontro a fenomeni di ricombinazione. Nella seconda parte di questo abbiamo analizzato il ruolo della protrusione-3’ telomerica nel regolare i telomeri umanizzati. Attraverso un saggio G-Tail abbiamo evidenziato che la protrusione-3’ nel ceppo HY, pur se più lunga rispetto al ceppo selvatico, viene regolata durante il ciclo cellulare e raggiunge la massima estensione in G2 mentre è più corta in G1. L’analisi della protrusione-3’ ha rivelato che, nella maggior parte dei casi in cellule HY proliferanti, è presente una coda con lunghezza compresa tra 24 e 48 nt. Il successivo studio dei mutanti ha anche rivelato che per la regolazione della protrusione-3’ è determinante la presenza della proteina checkpoint Tel1 e che in assenza del gene Rad50, che fa parte del complesso MRX, la regione di DNA telomerico a singolo filamento si riduce notevolmente, quasi a scomparire. Abbiamo inoltre osservato nei ceppi in cui la coda a singolo è più corta anche un accorciamento del telomero rispetto al ceppo di riferimento HY. Un evento inatteso, osservato in questi ceppi, è l’esistenza di fenomeni di amplificazione del subtelomero Y’ pur in presenza di una telomerasi attiva. L’amplificazione del subtelomero Y’ è presente nei ceppi HY ed aumenta con il passare delle generazioni; si osserva amplificazione anche nei ceppi HY rad50 ma non nei mutanti rad51 suggerendo che queste cellule hanno le caratteristiche dei survivors Type I. Questo fenomeno è abbastanza insolito, perché avviene in presenza di una telomerasi attiva ed in cellule che non sono state interessate da una fase di senescenza. Inoltre, abbiamo evidenziato un ruolo di Tel1 nella regolazione di questo processo. Infatti nei doppi mutanti HY tel1, rad50 e HY tel1 rad51, il fenotipo precedentemente descritto tipico dei survivors Type I si inverte suggerendo l’esistenza di un meccanismo di amplificazione del Y’ Rad51-indipendente che opera in assenza di Tel1. L’importanza di Tel1, nel regolare i telomeri umanizzati, è evidenziata dai saggi di immunoprecipitazione della cromatina, che rivelano un arricchimento significativo di questa proteina al telomero umanizzato rispetto al ceppo selvatico. L’attivazione dei meccanismi ALT normalmente insorge dopo una fase di senescenza che segue la perdita di attività telomerasica, sia in cellule di lievito che di mammifero (Lendvay et al., 1996). Nei ceppi di lievito con telomeri umanizzati si osserva un amplificazione del subtelomero Y’ anche in presenza di attività telomerasica, suggerendo che questo processo possa essere attivato da una inappropriata regolazione e/o struttura del telomero. La presenza di una coda a singolo filamento più lunga rispetto al ceppo selvatico potrebbe indurre ad ipotizzare un suo ruolo positivo nell’innesco per l’attivazione del processo di ricombinazione ALT; tali meccanismi sono infatti attivati da fattori come Rad51 che potrebbero competere con le proteine che regolano il caricamento della telomerasi come Cdc13 per l’accesso al DNA telomerico a singolo filamento.

Telomeres protect the ends of eukaryotic chromosomes from undesired processes such as deletions, loss of genomic information due to end replication problem and degradation. Telomerase is an essential enzyme required to maintain the appropriate number of telomere repeats counteracting the loss of terminal DNA due to conventional DNA replication. In fact, loss of a critical number of telomeric DNA repeats leads to cell-cycle arrest, mediated by the DNA damage checkpoint pathways, with important implications in many eukaryotes including human. Telomere structure is basically conserved between human and yeast, opening the possibility to study human telomeres in a more amenable genetic system such as budding yeast. Moreover, since some of the telomeric proteins, belong to essential gene in Saccharomyces cerevisiae, such as Rap1, the role of such genes can be studied by altering the telomere sequence thereby blocking the binding of proteins normally associated with telomere. We have proposed the use yeast with humanized telomeres in, obtained by reprogramming the RNA component of the telomerase complex. These telomeres, which are not bound by Rap1, are regulated by an alternative length regulation pathway that allow cell survival with apparently no telomeric defects. Herein we report the presence of telomeric fusions in yeast cells harbouring human telomeres (HY strains) and we investigate on the possible role of G-tail on telomere maintenance. In the first part of this work we report that budding yeasts carrying human-type telomeric repeats at their chromosome termini show a chronic activation of the Rad53- dependent DNA damage checkpoint pathway and a G2/M cell cycle delay. Furthermore, in the absence of either TEL1/ATM or MEC1/ATR genes, which encoder phosphatidylinositol 3-kinaserelated kinases (PIKKs), we detected telomere fusions, whose appearance correlates with a reduced cell viability and a high rate of genome instability. Based on sequence analysis, telomere fusions occurred primarily between ultrashort telomeres. Microcolony formation assays argue against the possibility that fusion-containing cells are eliminated by PIKKdependent signaling. These findings reveal that humanized telomeres in yeast cells are sensed as a chronically damaged DNA but do not greatly impair cell viability as long as the cells have a functional DNA damage checkpoint. These results suggest that PIKK kinases are important for the ability of HY cells to tolerate a certain amount of chronic telomere damage, even though in other contexts, they prevent the proliferation of cells with acute telomere damage. In the second part of the work we have investigated the length of the 3’protruding chromosome end which, in yeast telomeres, is very short (at the limit of detection) in nonsynchronized cells, whereas they are longer (50-100nt) in late S-phase. In our study we have detected G-tails in non-synchronized yeast cells with human telomeres suggesting that they are longer and/or maintained through the cell cycle with respect to canonical yeast telomeres. Analysis of G-tails modulation during cell cycle showed that the length of the telomeric 3’- overhang is regulated in the course of the cell cycle. Short G-tails are present in G1, progressively increases in S phase and is maximum in G2. Additionally we have shown that cells lacking either Tel1 or Rad50 have shot G-tail and this phenotype is also associated with short telomere. This evidence suggest that either Tel1 and Rad50 pathway promotes telomere elongation through the regulation of the G-tail. Importantly we found that the HY rad51 mutant, with a 3’-overhang similar in length to the reference strain HY, shows extremely long telomeres. This result let us to speculate on a possible role Rad51 in the telomere regulation, probably through a competition with Cdc13 for the telomeric single strand binding. This hypothesis has been corroborated by the evidence that HY strains undergo Y’ amplification in a Rad51-dependent manner, without hallmark of senescence and in the presence of a functional telomerase. To confirm our hypothesis of a competition between Rad51 and Cdc13 for the telomeric single strand access, we are setting ChIP experiments to measure the levels of Rad51 binding to humanized telomere. An added layer of complexity is provided by the analysis of double mutants HY tel1 rad51, which showed an increased level of Y’ amplification. This strain have short G-tail and short telomere, according to the Tel1 involvement in the modulation of the 3’ overhang and telomerase engagement, however the presence of a Rad51-indipendent Y’ amplification mechanism, suggest that Tel1 hold a central role, also in the control of the ALT mechanisms. Another clue of the importance of Tel1 is provided by ChIP analysis. Actually we have reported, a significative higher level of Tel1 binding in humanized telomere in G2, with respect to the wild type strain. This considerations suggests that the Tel1 pathway for promoting telomere elongation is the result of a multilevel control of this checkpoint protein, on different process such as the G-tail modulation, telomerase loading and activation of ALT mechanisms.