Plant cell cultures as ingredients for 3D-(bio)printing of next generation healthy food

Mastrobuono, Valentina

Plant cell cultures as ingredients for 3D-(bio)printing of next generation healthy food

Author(s)

Mastrobuono, Valentina

Date Issued

October 21, 2025

Type

Doctoral Thesis

Abstract

Addressing global challenges such as climate change, reduction of arable land, natural resources erosion, and increasing food demand, requires research on innovative strategies to possibly complement traditional agriculture. Cellular agriculture offers a promising solution in this scenario, by using cell cultures from a wide variety of organisms – animals, plants, and microorganisms – as such to produce agricultural commodities, rather than farmed animals or crops. The present doctoral project focuses specifically on plant cell agriculture, aiming to formulate novel, value-added food through the help of 3D printing. These novel foods integrate cells from plant suspension cultures and value-added by-products from the agri-food industry. In the perspective of combining such different matrices (i.e., value-added by-products and plant cells), the additive manufacturing approach enables controlled, standardized, and potentially sustainable production of these novel foods. 3D food printing represents an opportunity to expand available food sources by utilizing these unconventional matrices simultaneously valorizing waste materials. Indeed, this technology allows the creation of customized foods in terms of shape, texture, flavor, color, and nutritional content, which can also deceive the palate by providing satisfaction even in the absence of sapid or sweet ingredients, that may be considered unhealthy. In the present work, to produce cellular biomass, selected microgreen species, were chosen as the starting material for the onset of plant cell cultures. Microgreens are plantulae harvested 7 to 15 days after sowing, fully edible for some species, and characterized by phytonutrient concentrations that may reach up to 40 times higher than those found at the adult stage. The selected species included Ocimum basilicum purpurascens (var. red rubin), Perilla frutescens purpurascens (var. shiso purple), Beta vulgaris (var. rubra). Selection criteria prioritized factors such as health benefit and technological value in food manufacturing processes (i.e., bio-accumulation of value-added secondary metabolites belonging either to the class of phenylpropanoids or betalains; antioxidant capacity, radical-scavenging activity, hypolipidemic effects, or antimicrobial properties) Growth kinetics of the obtained callus cultures were evaluated. To optimize the growth of the O. basilicum and P. frutescens cultures in terms of dry weight and to modulate metabolites accumulation, different media formulations and physical elicitation strategies based on LED lights at fixed intensity and at different wavelengths (i.e., Blue light 460 nm, 50 μM/m²/s; Red light, 660 nm, 50 μM/m²/s), and their combination (Red and Blue light, 660 nm + 460 nm, 25 μM/m²/s) were explored. The condition resulting in maximum dry matter accumulation was selected. Physical elicitation using LED light was preferred over chemical elicitation to reduce possible issues risks associated with human consumption. Pigmented friable callus cultures obtained from Ocimum basilicum purpurascens (var. red rubin), and B. vulgaris var. rubra, were selected for their potential to accumulate anthocyanins and betalains (betacyanin and betaxanthin), respectively, and evaluated for their response to different media compositions. After establishing optimal extraction protocols for each species, hydroalcoholic extracts of cultures were analyzed by UV-visible spectroscopy. Suspension cultures of Perilla frutescens, Ocimum basilicum, and Beta vulgaris were established and characterized in terms of growth kinetics and UV-visible profile. Additionally, a comparative analysis of antioxidant activity and polyphenol content was performed among P. frutescens and O. basilicum suspension cultures and the starting callus in the best-performing culture conditions, revealing that the suspension cultures exhibited the highest polyphenol accumulation and the greatest antioxidant capacity. Perilla frutescens var. shiso purple was chosen as the model system for the subsequent experiments due to its rapid growth and UV-visible profile, making it suitable for devising a proof-of-concept, plant cell-based food. To enhance suitability of plant cell cultures to food applications, cell growth media were modified by reducing or replacing traditional synthetic plant growth regulators with relatively low acceptable daily intake (ADI). A different growth medium was evaluated for Perilla frutescens callus culture, in absence of 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and in presence of by-products from the agro-industry such as casein hydrolysate, a by-product of the dairy industry, which provides essential nutrients and growth factors, offering a natural alternative to synthetic components, besides a solution to recycle a side-stream agri-food product. Furthermore, a physical elicitation by Blue LED light was applied in P. frutescens suspension culture grown in a modified medium containing low concentrations of potentially toxic plant growth regulators, like 6- Benzylaminopurine (6-BAP), aiming to achieve a metabolic profile comparable to that generated in the culture by the original culture media, while ensuring greater compliance with food safety standards. Metabolomic analysis highlighted differences between callus and suspension cultures of Perilla frutescens, with light emerging as a key factor in metabolite accumulation. LED light exposure, particularly Blue light (Blue light 460 nm, 50 μM/m²/s), promoted the biosynthesis of several bioactive compounds. Although certain metabolites were exclusive to each culture, such as rosmarinic acid and tyrosine in the callus, or p-coumaric acid, erythronic acid and vitamin B5 in the suspension, suspension culture generally showed higher overall concentrations. Notably, suspension culture grown under Blue light conditions, more suitable for food purposes, displayed a metabolite profile rich in secondary compounds of nutraceutical interest, including chlorogenic acid, amino acids, B vitamins. In the context of the pre-industrialization of prototype food products, cells were encapsulated in pectin-based hydrogels, the latter in view of the application of additive manufacturing (3D-printing). To improve the final product sustainability/circularity and to achieve optimal conditions for hydrogel formation, extracts derived from agri-food by-products and fruit juices were included in the formulation. Extracts of manufacturing value-added by-products from berries (strawberry and blueberry), specifically obtained in citric acid, and a value-added apple juice, were used as the solutions allowing the inclusion of Perilla frutescens cells suspension cultures into hydrogels suitable for 3D-printing. The compatibility of the extracts and of the juice with cells was assessed by the preservation of cell integrity and viability. Thereafter the final recipe for the whole cell-containing hydrogel was devised, the compatibility evaluations were conducted on the whole ink, as well. Possible alteration of compounds of interest was evaluated through UV-visible analysis. In addition to the ink specifically designed for the inclusion of plant cell cultures, three further ink recipes were formulated that included agro-industrial by-products, high-value-added fruit juices, honey, carob seed flour (a natural chocolate substitute), banana powder and pectin. These inks were devised to enable the production of two final products: 1) a multilayer bar composed of an external biscuit-like shell, an intermediate layer of white chocolate-like filling, and an internal core of gelée filling for the inclusion of cells and 2) a honey-based sphere with an inner gelée filling containing cells. The formulation of the inks was crucial to ensuring the structural integrity and of the two final products, demonstrating high printability, compatibility with the ingredients and viability of the embedded cells. The shelf life of the inks was determined through microbiological tests, including assessments of total aerobic mesophilic microflora, yeast and mold counts, as well as physicochemical assessments such as pH measurement over time, water activity, water content, hardness and humidity levels, chemical composition, and water release kinetics. Further analyses involved defining physicochemical characteristics, optimizing printing parameters, and assessing the mechanical texture profile. The overall results confirmed the good quality of the developed inks, giving a clue on the combination of formulation, technological treatment and storage conditions to guarantee the microbiological stability and chemical-physical integrity of the products over time. Finally, the two final products were evaluated for their sensory attributes and consumer acceptance through a panel test, a preliminary preference test, and an online questionnaire. The panel test showed that the inclusion of plant cell cultures improved the consistency of the product while the consumer test showed that the product's attractiveness increased significantly after learning about the composition and benefits of these new foods. In conclusion, the results of this work highlight the potential of plant cell cultures far beyond their traditional application, envisaging possible production approaches for high-value, plant-derived food without fields. In addition, they show the prospect of the integration of plant cell cultures and of agro- industrial by-products in innovative 3D printing food applications.

Affrontare sfide globali quali il cambiamento climatico, la riduzione dei terreni coltivabili, l'erosione delle risorse naturali e l'aumento della domanda alimentare richiede la ricerca di strategie innovative che possano integrare l'agricoltura tradizionale. L'agricoltura cellulare offre una soluzione promettente in questo scenario, utilizzando colture cellulari provenienti da un'ampia varietà di organismi - animali, piante e microrganismi - per produrre prodotti agricoli, piuttosto che animali da allevamento o colture. Il presente progetto di dottorato si concentra specificamente sull'agricoltura cellulare vegetale, con l'obiettivo di formulare alimenti innovativi e a valore aggiunto attraverso l'aiuto della stampa 3D. Questi nuovi alimenti integrano cellule provenienti da colture vegetali in sospensione e sottoprodotti a valore aggiunto dell'industria agroalimentare. Nella prospettiva di combinare matrici così diverse (cioè sottoprodotti a valore aggiunto e cellule vegetali), l'approccio della produzione additiva consente una produzione controllata, standardizzata e potenzialmente sostenibile di questi nuovi alimenti. La stampa 3D di alimenti rappresenta un'opportunità per ampliare le fonti alimentari disponibili utilizzando queste matrici non convenzionali e valorizzando contemporaneamente i materiali di scarto. Infatti, questa tecnologia consente la creazione di alimenti personalizzati in termini di forma, consistenza, sapore, colore e contenuto nutrizionale, che possono anche ingannare il palato fornendo soddisfazione anche in assenza di ingredienti sapidi o dolci, che potrebbero essere considerati malsani. Nel presente lavoro, per produrre biomassa cellulare, sono state scelte alcune specie di microverdure come materiale di partenza per l'avvio delle colture di cellule vegetali. Le microverdure sono piantine raccolte da 7 a 15 giorni dopo la semina, completamente commestibili per alcune specie e caratterizzate da concentrazioni di fitonutrienti che possono raggiungere valori fino a 40 volte superiori a quelli riscontrati nella fase adulta. Le specie selezionate includevano Ocimum basilicum purpurascens (var. red rubin), Perilla frutescens purpurascens (var. shiso purple), Beta vulgaris (var. rubra). I criteri di selezione hanno dato priorità a fattori quali i benefici per la salute e il valore tecnologico nei processi di produzione alimentare (ad esempio, bioaccumulo di metaboliti secondari a valore aggiunto appartenenti alla classe dei fenilpropanoidi o delle betalaine; capacità antiossidante, attività di eliminazione dei radicali liberi, effetti ipolipidemici o proprietà antimicrobiche). È stata valutata la cinetica di crescita delle colture di callo ottenute. Per ottimizzare la crescita delle colture di O. basilicum e P. frutescens in termini di peso secco e per modulare l'accumulo di metaboliti, sono state utilizzate diverse formulazioni di terreni di coltura e strategie di stimolazione fisica basate su luci LED a intensità fissa e a diverse lunghezze d'onda ( luce blu 460 nm, 50 μM/m²/s; luce rossa, 660 nm, 50 μM/m²/s) e la loro combinazione (luce rossa e blu, 660 nm + 460 nm, 25 μM/m²/s). È stata selezionata la condizione che ha portato al massimo accumulo di sostanza secca. L'elicitazione fisica mediante luce LED è stata preferita all'elicitazione chimica per ridurre i possibili rischi associati al consumo umano. Le colture di callo friabile pigmentato ottenute da O. basilicum purpurascens (var. red rubin) e B. vulgaris var. rubra sono state selezionate per il loro potenziale di accumulo rispettivamente di antociani e betalaine (betacianina e betaxantina) e valutate per la loro risposta a diverse composizioni di terreni di coltura. Dopo aver stabilito i protocolli di estrazione ottimali per ciascuna specie, gli estratti idroalcolici delle colture sono stati analizzati mediante spettroscopia UV-visibile. Sono state stabilite colture in sospensione di Perilla frutescens, Ocimum basilicum e Beta vulgaris che sono state caratterizzate in termini di cinetica di crescita e profilo UV-visibile. Inoltre, è stata eseguita un'analisi comparativa dell'attività antiossidante e del contenuto di polifenoli tra le colture in sospensione di P. frutescens e O. basilicum e il callo iniziale nelle condizioni colturali più performanti, rivelando che le colture in sospensione presentavano il più alto accumulo di polifenoli e la maggiore capacità antiossidante. Perilla frutescens var. shiso purple è stata scelta come sistema modello per gli esperimenti successivi grazie alla sua rapida crescita e al suo profilo UV-visibile, che la rendono adatta alla creazione di un alimento a base di cellule vegetali (proof-of-concept). Per migliorare l'idoneità delle colture di cellule vegetali alle applicazioni alimentari, i terreni di coltura cellulare sono stati modificati riducendo o sostituendo i tradizionali regolatori di crescita vegetale sintetici con un'assunzione giornaliera accettabile (ADI) relativamente bassa. È stato valutato un terreno di coltura diverso per la coltura di calli di P. frutescens, in assenza di acido 2,4-diclorofenossiacetico (2,4-D) e in presenza di sottoprodotti dell'industria agroalimentare come l'idrolizzato di caseina, un sottoprodotto dell'industria lattiero- casearia, che fornisce nutrienti essenziali e fattori di crescita, offrendo un'alternativa naturale ai componenti sintetici, oltre a una soluzione per riciclare un prodotto agroalimentare secondario. Inoltre, è stata applicata un'elicitazione fisica mediante luce LED blu nella coltura in sospensione di P. frutescens cresciuta in un mezzo modificato contenente basse concentrazioni di regolatori della crescita delle piante potenzialmente tossici, come la 6-benzilaminopurina (6-BAP), con l'obiettivo di ottenere un profilo metabolico paragonabile a quello generato nella coltura dai terreni di coltura originali, garantendo al contempo una maggiore conformità agli standard di sicurezza alimentare. L'analisi metabolomica ha evidenziato differenze tra le colture di callo e in sospensione di P. frutescens, con la luce che emerge come fattore chiave nell'accumulo di metaboliti. L'esposizione alla luce LED, in particolare alla luce blu (luce blu 460 nm, 50 μM/m²/s), ha promosso la biosintesi di diversi composti bioattivi. Sebbene alcuni metaboliti fossero esclusivi di ciascuna coltura, come l'acido rosmarinico e la tirosina nel callo, o l'acido p-cumarico, l'acido eritronico e la vitamina B5 nella sospensione, la coltura in sospensione ha generalmente mostrato concentrazioni complessive più elevate. In particolare, la coltura in sospensione cresciuta in condizioni di luce blu, più adatta per scopi alimentari, ha mostrato un profilo metabolico ricco di composti secondari di interesse nutraceutico, tra cui acido clorogenico, aminoacidi e vitamine del gruppo B. Nel contesto della preindustrializzazione di prototipi di prodotti alimentari, le cellule sono state incapsulate in idrogel a base di pectina, questi ultimi in vista dell'applicazione della produzione additiva (stampa 3D). Per migliorare la sostenibilità/circolarità del prodotto finale e ottenere condizioni ottimali per la formazione dell'idrogel, nella formulazione sono stati inclusi estratti derivati da sottoprodotti agroalimentari e succhi di frutta. Gli estratti di sottoprodotti a valore aggiunto derivati dai frutti di bosco (fragole e mirtilli), ottenuti specificatamente in acido citrico, e un succo di mela a valore aggiunto sono stati utilizzati come soluzioni che hanno permesso l'inclusione di colture di cellule di P. frutescens in sospensione in idrogel adatti alla stampa 3D. La compatibilità degli estratti e del succo con le cellule è stata valutata in base alla conservazione dell'integrità e della vitalità cellulare. Successivamente è stata elaborata la ricetta finale per l'idrogel contenente cellule intere e sono state condotte valutazioni di compatibilità anche sull'inchiostro intero. La possibile alterazione dei composti di interesse è stata valutata attraverso l'analisi UV-visibile. Oltre all'inchiostro specificamente progettato per l'inclusione di colture di cellule vegetali, sono state formulate altre tre ricette di inchiostro che includevano sottoprodotti agroindustriali, succhi di frutta ad alto valore aggiunto, miele, farina di semi di carruba (un sostituto naturale del cioccolato), polvere di banana e pectina. Questi inchiostri sono stati ideati per consentire la produzione di due prodotti finali: 1) una barretta multistrato composta da un guscio esterno simile a un biscotto, uno strato intermedio di ripieno simile al cioccolato bianco e un nucleo interno di ripieno gelatinoso per l'inclusione delle cellule e 2) una sfera a base di miele con un ripieno gelatinoso interno contenente cellule. La formulazione degli inchiostri è stata fondamentale per garantire l'integrità strutturale dei due prodotti finali, dimostrando un'elevata stampabilità, compatibilità con gli ingredienti e vitalità delle cellule incorporate. La durata di conservazione degli inchiostri è stata determinata attraverso test microbiologici, tra cui valutazioni della microflora mesofila aerobica totale, del conteggio di lieviti e muffe, nonché valutazioni fisico-chimiche quali la misurazione del pH nel tempo, l'attività dell'acqua, il contenuto d'acqua, i livelli di durezza e umidità, la composizione chimica e la cinetica di rilascio dell'acqua. Ulteriori analisi hanno riguardato la definizione delle caratteristiche fisico-chimiche, l'ottimizzazione dei parametri di stampa e la valutazione del profilo della struttura meccanica. I risultati complessivi hanno confermato la buona qualità degli inchiostri sviluppati, fornendo un indizio sulla combinazione di formulazione, trattamento tecnologico e condizioni di conservazione per garantire la stabilità microbiologica e l'integrità chimico-fisica dei prodotti nel tempo. Infine, i due prodotti finali sono stati valutati per le loro caratteristiche sensoriali e l'accettazione da parte dei consumatori attraverso un test di panel, un test di preferenza preliminare e un questionario online. Il test di panel ha dimostrato che l'inclusione di colture di cellule vegetali ha migliorato la consistenza del prodotto, mentre il test sui consumatori ha dimostrato che l'attrattiva del prodotto è aumentata in modo significativo dopo aver appreso la composizione e i benefici di questi nuovi alimenti. In conclusione, i risultati di questo lavoro evidenziano il potenziale delle colture di cellule vegetali ben oltre la loro applicazione tradizionale, prevedendo possibili approcci di produzione per alimenti di alto valore derivati dalle piante senza campi. Inoltre, mostrano la prospettiva dell'integrazione delle colture di cellule vegetali e dei sottoprodotti agroindustriali in applicazioni innovative di stampa 3D di alimenti.

Additional information

Dottorato di ricerca in Scienze delle Produzioni Vegetali e Animali

Handle

https://dspace.unitus.it/handle/2067/70930

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