Molecular and immunological approach in the study of host-parasite interaction: the case study of anisakid species and human accidental host
Author(s)
Colantoni, Alessandra
Date Issued
June 4, 2018
Type
Doctoral Thesis
Abstract
I nematodi anisakidi appartenenti al genere Anisakis sono parassiti eterogeni che coinvolgono nel loro ciclo vitale i mammiferi marini (principalmente cetacei) come ospiti definitivi, mentre i crostacei (krill), i pesci e i calamari rappresentano i loro ospiti intermedi/paratenici. Questi parassiti sono considerati tra i più importanti “biological hazards” presenti nei prodotti "a base di pesce". Infatti, le fasi larvali dei generi Anisakis sono state segnalate come responsabili di infezioni accidentali umane (anisakiasi).
Lo scopo principale del progetto di ricerca di dottorato è stato quello di chiarire i meccanismi molecolari e immunologici coinvolti nella zoonosi innescata da Anisakis spp. nell'ospite accidentale (uomo). Inoltre, un altro obiettivo della tesi di dottorato è stato il miglioramento degli strumenti diagnostici per l'identificazione specifica e sensibile dell'agente eziologico dell'anisakiasi umana. A tal fine, è stato adottato un approccio multi-metodologico. Obiettivi specifici del progetto erano: 1) lo sviluppo di un metodo RT-PCR-Multiplex basato su primers/sonde specie-specifici progettati per amplificare sequenze del gene cox2 (mtDNA), per il rilevamento molecolare dell’agente eziologico anche quando presente in quantità molto basse, come nella biopsia gastrica o intestinale e nei granulomi rimossi dai casi umani; 2) fornire uno strumento diagnostico innovativo basato sulle analisi di immunofissazione per una corretta sierodiagnosi di anisakiasi allergica dovuta a una delle principali specie zoonotiche (ad es. A. pegreffii) 3) analisi e caratterizzazione degli antigeni considerati "principali allergeni" nella specie zoonotica A pegreffi; 4) valutare i livelli di espressione genica delle proteine di A. pegreffii coinvolte nella risposta immunitaria dell'ospite in relazione a diverse temperature e intervalli di tempo; 5) indagare l'interazione tra A. pegreffii - cellule dendritiche (DCs) coinvolte nella risposta immunitaria umana. Gli obiettivi specifici dei lavori presentati in questa tesi erano: • Articolo I “Sviluppo del sistema primers/sonde specie-specifici per identificare i parassiti dei pesci dei generi Anisakis e Pseudoterranova (Nematoda: Anisakidae)”. Abbiamo sviluppato un sistema di primers/sonde specifici per il gene cox2 (mtDNA) per l'identificazione di cinque specie di nematodi anisakidi appartenenti ai generi Anisakis (cioè A. pegreffii e A. simplex (ss)) e altri nematodi anisakidi, come Pseudoterranova decipiens (ss), P. krabbei e P. bulbosa (che si trovano spesso in co-infezione in ospiti naturali) da utilizzare in una reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR). Considerando la sensibilità e la natura quantitativa dei saggi, il nuovo sistema di primers/sonde può rappresentare uno strumento utile per la futura ricerca di base e applicata per l'identificazione di larve di Anisakis spp., Pseudoterranova spp. e H. aduncum nei pesci, anche in co-infezioni, con un potenziale di applicazione in industrie di trasformazione del pesce, mercati ittici e produttori di alimenti. • Articolo II “Sensibilizzazione delle IgE ad Anisakis pegreffii in Italia: confronto di due metodi per la diagnosi di anisakiasi allergica”. Il lavoro rappresenta il primo studio in cui sono stati caratterizzati antigeni/allergeni specie-specifici di A. pegreffii riconosciuti dalla risposta anticorpale IgE mediata. E' stata studiata, per la prima volta, la reazione IgE contro antigeni ESP (prodotti escretori secretori ottenuti da colture in vitro) e da estratto crudo (CE) di A. pegreffii, confrontando i dati ottenuti dall'approccio generalmente usato per diagnosticare l'allergia da Anisakis (immunoCAP, iCAP), con quelli osservati all'analisi immunoblotting (IgE-WB). Lo studio ha permesso di individuare antigeni/allergeni ESP che possono essere utilizzati nella diagnosi di GAA e di ipersensibilità IgE mediata ad A. pegreffii. Tra i 110 soggetti, 28 hanno mostrato positività alle IgE con entrambi i metodi WB e iCAP; 13 dimostrarono la reattività delle IgE, nel saggio WB, agli antigeni ESP di A. pegreffii, qui provvisoriamente indicati come Ani s 1-like, Ani s 7-like, Ani s 13-like; solo 15 sieri hanno mostrato una reazione di IgE-WB con Ani s 7-like e Ani s 13-like. iCAP e WB hanno mostrato un valore di concordanza elevato (k = 1,00) quando il valore iCAP era <0,35 (risultato negativo) e > 50,0 (risultato positivo). Nei campioni di sieri registrati come positivi all'allergia all'anisakis, Ani s 1-like era responsabile del 46,4% della sensibilità, mentre Ani s 7-like e Ani s 13-like per il 100%. Secondo i risultati, iCAP è un metodo affidabile per il rilevamento di IgE di A. pegreffii durante un primo screening per la sensibilizzazione contro gli allergeni del parassita. Il nostro suggerimento è di considerare i sieri che mostrano valori di iCAP inferiori a 0,35 kUA / l come veramente negativi, in accordo con gli studi precedenti; questo significa che questi sieri non richiedono ulteriori analisi. D'altra parte, la positività dei sieri con valori iCAP superiori deve essere confermata usando IgE-WB, o ELISA, impiegando antigeni ESP piuttosto che CE, specialmente nel caso di pazienti che presentano sintomi allergici in seguito al consumo di pesce. • Articolo III “Anisakiasi invasiva da parte del parassita Anisakis pegreffii (Nematoda: Anisakidae): diagnosi mediante PCR in tempo reale con sistema di sonde di idrolisi e saggio di immufissazione”. L'anisakiasi è una zoonosi di origine marina causata da larve di Anisakis spp. Una questione spinosa nella diagnosi dell’anisakiasi è la rilevazione molecolare dell'agente eziologico poichè spesso presente in quantità molto basse nelle biopsie gastriche o intestinali e nei granulomi. Gli obiettivi di questo studio erano: 1) identificare tre nuovi casi di anisakiasi invasiva, mediante la metodica PCR in tempo reale (RT-PCR) con l’impiego del sistema primers/sonde specie-specifici; 2) rilevare la risposta immunitaria dei pazienti contro il patogeno. L'identificazione delle larve rimosse a livello gastrico e intestinale da due pazienti è stata inizialmente ottenuta mediante analisi delle sequenze dei geni cox2 (mtDNA) ed EF1 α-1 (nDNA). Ciò non è stato possibile nel terzo paziente, a causa della quantità di DNA molto bassa, ottenuta da una singola sezione istologica di un granuloma asportato chirurgicamente. La metodica RT-PCR basata sul gene cox2 del mtDNA, è stata eseguita sul tessuto dei parassiti ottenuto dai tre casi. Inoltre mediante immunifissazione è stata studiata la risposta immunitaria IgE, IgG4 e IgG contro gli antigeni A. pegreffii. Secondo il sequenziamento dei geni cox2 (mtDNA) e l'EF1 α-1 (nDNA), le larve dello stomaco e dell'intestino dei due pazienti sono state assegnate a A. pegreffii. L’analisi mediante RT-PCR ha mostrato un segnale fluorescente a 510 nm per A .Pegreffii, in tutti e tre i casi. Nel saggio di immunofissazione, il paziente CC1 ha mostrato reattività IgE e IgG4 contro Ani s 13-like e Ani s 7-like; il paziente CC2 ha rivelato solo reattività IgG contro Ani s 13-like e Ani s 7-like; mentre il terzo paziente ha mostrato reattività IgE e IgG contro Ani s 13-like , Ani s 7-like e Ani s 1-like. Il sistema RT-PCR è risultato un metodo più sensibile rispetto al sequenziamento diretto del DNA per l'identificazione accurata e rapida dell'agente eziologico dell'anisakiasi umana. Lo studio ha evidenziato anche l'importanza di utilizzare sia strumenti molecolari che immunologici nella diagnosi dell’anisakiasi umana, al fine di aumentare la conoscenza dei reperti patologici e della risposta immunitaria correlati all'infezione da parte di specie zoonotiche del genere Anisakis. • Articolo IV “Trascritti temperatura-dipendenti di antigeni secretori escretori di larve di A. pegreffii mantenute in vitro (Nematodi: Anisakidae)”. I nematodi marini del genere Anisakis sono distribuiti in specie di pesci e calamari in tutto il mondo. Tra questi, A. pegreffi e A. simplex (s.s.) sono noti per causare la malattia zoonotica umana, anisakiasi. Finora, in Italia, A. pegreffii è stato segnalato come agente causale di anisakiasi invasiva e allergica. Durante tutte le fasi del loro ciclo vitale, i nematodi producono e rilasciano una varietà di prodotti escretori / secretori (ESP), che possono essere attori chiave nel meccanismo delle interazioni parassita-ospite. Gli ESP hanno diverse funzioni durante l'infezione, ad es. nella penetrazione dei tessuti degli ospiti e nell’evasione delle risposte immunitarie dell'ospite. Allo stesso tempo, sono noti per suscitare risposte immunitarie (compresa la produzione di anticorpi) sia nei pesci che nei mammiferi. Inoltre, in studi precedenti è stata riportata una produzione temperatura dipendente di composti ES in larve di Anisakis spp.. Lo scopo del presente lavoro era di studiare un possibile effetto della temperatura sui livelli di espressione dell'mRNA di alcune proteine escretorie/secretorie considerate tra gli antigeni della specie A. pegreffii (A. peg-1, A. peg-7 e A. peg-13). A tal fine, le larve appena isolate di Anisakis pegreffii sono state tenute in vitro in diverse condizioni di temperature, imitando gli ospiti eterotermi 23°C (intermedi / paratenici), omeotermi 37°C (naturali e accidentali) e a 7 ° C (temperatura di migrazione larvale post-morte in vivo). I nematodi anisakidi sono stati assegnati alla specie A. pegreffii sulla base dell'analisi delle sequenze del mtDNA cox2 e della regione EF1 α-1 nDNA. Le sequenze dei geni A. peg-1, A. peg-7 e A. peg-13 sono state ottenute per la specie Anisakis pegreffii. Inoltre, le sequenze nucleotidiche ottenute da A. pegreffii sono state confrontate con quelle degli stessi geni in A. simplex (s.s.); infine, le sequenze di A. pegreffii e A. simplex (s.s.) sono state confrontate con quelle precedentemente riportate in GenBank, come sequenze di A. simplex (s.l.). Le metodiche di Real time-PCR (qPCR) e SDS-PAGE sono state utilizzate per valutare i livelli di espressione di A. peg-1, A. peg-7 e A. peg-13 in A. pegreffii in condizioni di temperatura diverse. La qPCR ha mostrato che i livelli di mRNA di A. peg-13 aumentano significativamente a basse temperature (7 ◦C), mentre a 23 ° C e 37 ° C (24h, 48h) non cambiano significativamente. L'analisi mediante SDS-PAGE ha mostrato reattività, a 7 ° C dopo 24 ore, verso l'antigene con una mobilità relativa (Mr) attorno a 37 kDa, corrispondente a A. peg-13. I nostri risultati suggeriscono che A. peg-13 (una mioglobina) può essere necessaria in condizioni di stress da freddo. In effetti, in letteratura, la mioglobina dei nematodi è nota per essere una proteina adattativa. Diversamente, i livelli del trascritto di A. peg-1, aumentavano gradualmente a 24 ore in condizioni di stress termico (37 ◦C); mentre ritornano a livelli normali dopo 48 ore. A 7 ° C l'espressione dell’mRNA di A. peg-1 non cambia significativamente. I nostri risultati suggeriscono che i livelli di espressione di A. peg-1 possono essere correlati alla temperatura e sono significativamente aumentati in caso di stress termico. Nel complesso, i nostri risultati indicano che a 37 ° i livelli di espressione genica e la produzione di ESP da parte delle larve di A. pegreffii hanno raggiunto i livelli più alti tra tutte le temperature di incubazione. • Articolo V “Anisakis pegreffii influenza la differenziazione e la funzione delle cellule dendritiche umane”. Le cellule dendritiche umane (DCs) mostrano cambiamenti fenotipici quando maturano in presenza di prodotti derivati da elminti. Queste modificazioni provocano spesso una polarizzazione della risposta immunitaria verso le cellule Th2 e le cellule T regolatorie contribuendo così alla tolleranza immunologica contro questi patogeni. In questo lavoro è stata studiata l'interazione tra DCs e larve del nematode zoonotico Anisakis pegreffii. Le larve di A. pegreffii sono state prelevate dagli ospiti intermedi (pesci) e le DCs derivate da monociti sono state co-coltivate in presenza delle larve vive (L) o dei suoi estratti crudi (CE). In entrambe le condizioni sperimentali A. pegreffii ha influenzato la vitalità delle DCs, ha ostacolato la maturazione della DCs riducendo l'espressione di molecole coinvolte nella presentazione e migrazione dell'antigene (cioè HLA-DR, CD86, CD83 e CCR7), ha aumentato i livelli di ROS fagosomali ed ha modulato la fosforilazione di ERK 1,2. È interessante notare che la larva viva sembrava modulare in modo diverso la secrezione da parte delle DCs di citochine e chemochine rispetto al CE. Questi risultati dimostrano per la prima volta il ruolo immunomodulatore di A. pegreffi sulla biologia e sulle funzioni delle DCs. Inoltre, suggeriscono un contributo dinamico delle DCs all'induzione e al mantenimento della risposta infiammatoria nei confronti di A. pegreffii.
Lo scopo principale del progetto di ricerca di dottorato è stato quello di chiarire i meccanismi molecolari e immunologici coinvolti nella zoonosi innescata da Anisakis spp. nell'ospite accidentale (uomo). Inoltre, un altro obiettivo della tesi di dottorato è stato il miglioramento degli strumenti diagnostici per l'identificazione specifica e sensibile dell'agente eziologico dell'anisakiasi umana. A tal fine, è stato adottato un approccio multi-metodologico. Obiettivi specifici del progetto erano: 1) lo sviluppo di un metodo RT-PCR-Multiplex basato su primers/sonde specie-specifici progettati per amplificare sequenze del gene cox2 (mtDNA), per il rilevamento molecolare dell’agente eziologico anche quando presente in quantità molto basse, come nella biopsia gastrica o intestinale e nei granulomi rimossi dai casi umani; 2) fornire uno strumento diagnostico innovativo basato sulle analisi di immunofissazione per una corretta sierodiagnosi di anisakiasi allergica dovuta a una delle principali specie zoonotiche (ad es. A. pegreffii) 3) analisi e caratterizzazione degli antigeni considerati "principali allergeni" nella specie zoonotica A pegreffi; 4) valutare i livelli di espressione genica delle proteine di A. pegreffii coinvolte nella risposta immunitaria dell'ospite in relazione a diverse temperature e intervalli di tempo; 5) indagare l'interazione tra A. pegreffii - cellule dendritiche (DCs) coinvolte nella risposta immunitaria umana. Gli obiettivi specifici dei lavori presentati in questa tesi erano: • Articolo I “Sviluppo del sistema primers/sonde specie-specifici per identificare i parassiti dei pesci dei generi Anisakis e Pseudoterranova (Nematoda: Anisakidae)”. Abbiamo sviluppato un sistema di primers/sonde specifici per il gene cox2 (mtDNA) per l'identificazione di cinque specie di nematodi anisakidi appartenenti ai generi Anisakis (cioè A. pegreffii e A. simplex (ss)) e altri nematodi anisakidi, come Pseudoterranova decipiens (ss), P. krabbei e P. bulbosa (che si trovano spesso in co-infezione in ospiti naturali) da utilizzare in una reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR). Considerando la sensibilità e la natura quantitativa dei saggi, il nuovo sistema di primers/sonde può rappresentare uno strumento utile per la futura ricerca di base e applicata per l'identificazione di larve di Anisakis spp., Pseudoterranova spp. e H. aduncum nei pesci, anche in co-infezioni, con un potenziale di applicazione in industrie di trasformazione del pesce, mercati ittici e produttori di alimenti. • Articolo II “Sensibilizzazione delle IgE ad Anisakis pegreffii in Italia: confronto di due metodi per la diagnosi di anisakiasi allergica”. Il lavoro rappresenta il primo studio in cui sono stati caratterizzati antigeni/allergeni specie-specifici di A. pegreffii riconosciuti dalla risposta anticorpale IgE mediata. E' stata studiata, per la prima volta, la reazione IgE contro antigeni ESP (prodotti escretori secretori ottenuti da colture in vitro) e da estratto crudo (CE) di A. pegreffii, confrontando i dati ottenuti dall'approccio generalmente usato per diagnosticare l'allergia da Anisakis (immunoCAP, iCAP), con quelli osservati all'analisi immunoblotting (IgE-WB). Lo studio ha permesso di individuare antigeni/allergeni ESP che possono essere utilizzati nella diagnosi di GAA e di ipersensibilità IgE mediata ad A. pegreffii. Tra i 110 soggetti, 28 hanno mostrato positività alle IgE con entrambi i metodi WB e iCAP; 13 dimostrarono la reattività delle IgE, nel saggio WB, agli antigeni ESP di A. pegreffii, qui provvisoriamente indicati come Ani s 1-like, Ani s 7-like, Ani s 13-like; solo 15 sieri hanno mostrato una reazione di IgE-WB con Ani s 7-like e Ani s 13-like. iCAP e WB hanno mostrato un valore di concordanza elevato (k = 1,00) quando il valore iCAP era <0,35 (risultato negativo) e > 50,0 (risultato positivo). Nei campioni di sieri registrati come positivi all'allergia all'anisakis, Ani s 1-like era responsabile del 46,4% della sensibilità, mentre Ani s 7-like e Ani s 13-like per il 100%. Secondo i risultati, iCAP è un metodo affidabile per il rilevamento di IgE di A. pegreffii durante un primo screening per la sensibilizzazione contro gli allergeni del parassita. Il nostro suggerimento è di considerare i sieri che mostrano valori di iCAP inferiori a 0,35 kUA / l come veramente negativi, in accordo con gli studi precedenti; questo significa che questi sieri non richiedono ulteriori analisi. D'altra parte, la positività dei sieri con valori iCAP superiori deve essere confermata usando IgE-WB, o ELISA, impiegando antigeni ESP piuttosto che CE, specialmente nel caso di pazienti che presentano sintomi allergici in seguito al consumo di pesce. • Articolo III “Anisakiasi invasiva da parte del parassita Anisakis pegreffii (Nematoda: Anisakidae): diagnosi mediante PCR in tempo reale con sistema di sonde di idrolisi e saggio di immufissazione”. L'anisakiasi è una zoonosi di origine marina causata da larve di Anisakis spp. Una questione spinosa nella diagnosi dell’anisakiasi è la rilevazione molecolare dell'agente eziologico poichè spesso presente in quantità molto basse nelle biopsie gastriche o intestinali e nei granulomi. Gli obiettivi di questo studio erano: 1) identificare tre nuovi casi di anisakiasi invasiva, mediante la metodica PCR in tempo reale (RT-PCR) con l’impiego del sistema primers/sonde specie-specifici; 2) rilevare la risposta immunitaria dei pazienti contro il patogeno. L'identificazione delle larve rimosse a livello gastrico e intestinale da due pazienti è stata inizialmente ottenuta mediante analisi delle sequenze dei geni cox2 (mtDNA) ed EF1 α-1 (nDNA). Ciò non è stato possibile nel terzo paziente, a causa della quantità di DNA molto bassa, ottenuta da una singola sezione istologica di un granuloma asportato chirurgicamente. La metodica RT-PCR basata sul gene cox2 del mtDNA, è stata eseguita sul tessuto dei parassiti ottenuto dai tre casi. Inoltre mediante immunifissazione è stata studiata la risposta immunitaria IgE, IgG4 e IgG contro gli antigeni A. pegreffii. Secondo il sequenziamento dei geni cox2 (mtDNA) e l'EF1 α-1 (nDNA), le larve dello stomaco e dell'intestino dei due pazienti sono state assegnate a A. pegreffii. L’analisi mediante RT-PCR ha mostrato un segnale fluorescente a 510 nm per A .Pegreffii, in tutti e tre i casi. Nel saggio di immunofissazione, il paziente CC1 ha mostrato reattività IgE e IgG4 contro Ani s 13-like e Ani s 7-like; il paziente CC2 ha rivelato solo reattività IgG contro Ani s 13-like e Ani s 7-like; mentre il terzo paziente ha mostrato reattività IgE e IgG contro Ani s 13-like , Ani s 7-like e Ani s 1-like. Il sistema RT-PCR è risultato un metodo più sensibile rispetto al sequenziamento diretto del DNA per l'identificazione accurata e rapida dell'agente eziologico dell'anisakiasi umana. Lo studio ha evidenziato anche l'importanza di utilizzare sia strumenti molecolari che immunologici nella diagnosi dell’anisakiasi umana, al fine di aumentare la conoscenza dei reperti patologici e della risposta immunitaria correlati all'infezione da parte di specie zoonotiche del genere Anisakis. • Articolo IV “Trascritti temperatura-dipendenti di antigeni secretori escretori di larve di A. pegreffii mantenute in vitro (Nematodi: Anisakidae)”. I nematodi marini del genere Anisakis sono distribuiti in specie di pesci e calamari in tutto il mondo. Tra questi, A. pegreffi e A. simplex (s.s.) sono noti per causare la malattia zoonotica umana, anisakiasi. Finora, in Italia, A. pegreffii è stato segnalato come agente causale di anisakiasi invasiva e allergica. Durante tutte le fasi del loro ciclo vitale, i nematodi producono e rilasciano una varietà di prodotti escretori / secretori (ESP), che possono essere attori chiave nel meccanismo delle interazioni parassita-ospite. Gli ESP hanno diverse funzioni durante l'infezione, ad es. nella penetrazione dei tessuti degli ospiti e nell’evasione delle risposte immunitarie dell'ospite. Allo stesso tempo, sono noti per suscitare risposte immunitarie (compresa la produzione di anticorpi) sia nei pesci che nei mammiferi. Inoltre, in studi precedenti è stata riportata una produzione temperatura dipendente di composti ES in larve di Anisakis spp.. Lo scopo del presente lavoro era di studiare un possibile effetto della temperatura sui livelli di espressione dell'mRNA di alcune proteine escretorie/secretorie considerate tra gli antigeni della specie A. pegreffii (A. peg-1, A. peg-7 e A. peg-13). A tal fine, le larve appena isolate di Anisakis pegreffii sono state tenute in vitro in diverse condizioni di temperature, imitando gli ospiti eterotermi 23°C (intermedi / paratenici), omeotermi 37°C (naturali e accidentali) e a 7 ° C (temperatura di migrazione larvale post-morte in vivo). I nematodi anisakidi sono stati assegnati alla specie A. pegreffii sulla base dell'analisi delle sequenze del mtDNA cox2 e della regione EF1 α-1 nDNA. Le sequenze dei geni A. peg-1, A. peg-7 e A. peg-13 sono state ottenute per la specie Anisakis pegreffii. Inoltre, le sequenze nucleotidiche ottenute da A. pegreffii sono state confrontate con quelle degli stessi geni in A. simplex (s.s.); infine, le sequenze di A. pegreffii e A. simplex (s.s.) sono state confrontate con quelle precedentemente riportate in GenBank, come sequenze di A. simplex (s.l.). Le metodiche di Real time-PCR (qPCR) e SDS-PAGE sono state utilizzate per valutare i livelli di espressione di A. peg-1, A. peg-7 e A. peg-13 in A. pegreffii in condizioni di temperatura diverse. La qPCR ha mostrato che i livelli di mRNA di A. peg-13 aumentano significativamente a basse temperature (7 ◦C), mentre a 23 ° C e 37 ° C (24h, 48h) non cambiano significativamente. L'analisi mediante SDS-PAGE ha mostrato reattività, a 7 ° C dopo 24 ore, verso l'antigene con una mobilità relativa (Mr) attorno a 37 kDa, corrispondente a A. peg-13. I nostri risultati suggeriscono che A. peg-13 (una mioglobina) può essere necessaria in condizioni di stress da freddo. In effetti, in letteratura, la mioglobina dei nematodi è nota per essere una proteina adattativa. Diversamente, i livelli del trascritto di A. peg-1, aumentavano gradualmente a 24 ore in condizioni di stress termico (37 ◦C); mentre ritornano a livelli normali dopo 48 ore. A 7 ° C l'espressione dell’mRNA di A. peg-1 non cambia significativamente. I nostri risultati suggeriscono che i livelli di espressione di A. peg-1 possono essere correlati alla temperatura e sono significativamente aumentati in caso di stress termico. Nel complesso, i nostri risultati indicano che a 37 ° i livelli di espressione genica e la produzione di ESP da parte delle larve di A. pegreffii hanno raggiunto i livelli più alti tra tutte le temperature di incubazione. • Articolo V “Anisakis pegreffii influenza la differenziazione e la funzione delle cellule dendritiche umane”. Le cellule dendritiche umane (DCs) mostrano cambiamenti fenotipici quando maturano in presenza di prodotti derivati da elminti. Queste modificazioni provocano spesso una polarizzazione della risposta immunitaria verso le cellule Th2 e le cellule T regolatorie contribuendo così alla tolleranza immunologica contro questi patogeni. In questo lavoro è stata studiata l'interazione tra DCs e larve del nematode zoonotico Anisakis pegreffii. Le larve di A. pegreffii sono state prelevate dagli ospiti intermedi (pesci) e le DCs derivate da monociti sono state co-coltivate in presenza delle larve vive (L) o dei suoi estratti crudi (CE). In entrambe le condizioni sperimentali A. pegreffii ha influenzato la vitalità delle DCs, ha ostacolato la maturazione della DCs riducendo l'espressione di molecole coinvolte nella presentazione e migrazione dell'antigene (cioè HLA-DR, CD86, CD83 e CCR7), ha aumentato i livelli di ROS fagosomali ed ha modulato la fosforilazione di ERK 1,2. È interessante notare che la larva viva sembrava modulare in modo diverso la secrezione da parte delle DCs di citochine e chemochine rispetto al CE. Questi risultati dimostrano per la prima volta il ruolo immunomodulatore di A. pegreffi sulla biologia e sulle funzioni delle DCs. Inoltre, suggeriscono un contributo dinamico delle DCs all'induzione e al mantenimento della risposta infiammatoria nei confronti di A. pegreffii.
Anisakid nematodes belonging to the genus Anisakis are heteroxenous parasites, involving marine mammals
(mainly cetaceans) as definitive hosts, while crustaceans (krill), fish and squids acting as intermediate/paratenic hosts in their life-cycles. These parasites are considered among the most important biological hazards present in “seafood” products. Indeed, larval stages of the genera Anisakis have been reported as responsible of human accidental infections (anisakiasis). Main aim of the Ph.D research project has been to add insight into the molecular and immunological mechanisms involved in the disease triggered by Anisakis spp. in the accidental host (humans). Moreover, improvement of the diagnostic tools for specific and sensible identification of etiological agent of human anisakiasis represented another aim of the Ph.D thesis. To this end, a multi-methodological approach has been carried out. Specific objectives of the project were: 1) development of a RT-PCR-Multiplex method based on species-specific primers designed to amplify sequences of the mtDNA cox2 gene, for the molecular detection of etiological agent oh human anisakidosis, even at very low quantity, such as in gastric or intestinal biopsy and granulomas removed from human cases; 2) to provide an innovative diagnostic tool based on Immunoblotting analysis for a correct serodiagnosis of allergic anisakiasis due to one of main zoonotic species (i.e. A. pegreffii) 3) analysis and characterization of the antigens considered "major allergens" in the zoonotic species A. pegreffi; 4) to evaluate the gene expression levels of A. pegreffii proteins involved in the host immunological response in relation to different temperatures and time intervals; 5) investigate the interaction between A.pegreffii - dendritic cells (DCs) involved in the human immune response. The specific aims of the Papers presented in this thesis were: • Paper I: Development of species-specific Real Time-PCR primers/probe systems to identify fish parasites of the genera Anisakis and Pseudoterranova (Nematoda: Anisakidae). We developed a primers/probe system for the identification of five species of anisakid nematodes belonging to the genera Anisakis (i.e. A. pegreffii and A. simplex (s. s.)), and other anisakid nematodes, such as Pseudoterranova decipiens (s. s.), P. krabbei and P. bulbosa (often occurring in co-infection in natural hosts) to be used in a Real time polymerase chain reaction (RT-PCR) with specific primers based on the mtDNA cox2 gene. Considering the sensibility and quantitative nature of the assays, the new primers/probe system may represent a useful tool for future basic and applied research that focuses on the identification of Anisakis spp., Pseudoterranova spp. and H. aduncum larvae in fish, even in co-infections, with a potential for application in fish farming, fish processing industries, fish markets, and food producers. • Paper II: IgE sensitization to Anisakis pegreffii in Italy: comparison of two methods for the diagnosis of allergic anisakiasis. IgE response was analyzed by immunoblotting (WB) assay, using both excretory/secretory products (ESPs) and crude extract (CE) of A. pegreffii larvae. The results were compared with those achieved by the conventional immunological method for Anisakis allergy (i.e. immunoCAP). Among the 110 subjects, 28 showed IgE positivity with both WB and iCAP methods; 13 proved IgE reactivity, in WB assay, to ESP antigens of A. pegreffii, here provisionally indicated as Ani s 1-like, Ani s 7-like, Ani s 13-like; only 15 sera have shown IgEWB reaction to Ani s 7-like and Ani s 13-like. iCAP and WB exhibited a high concordance value (k=1.00) when iCAP value was <0.35 (negative result) and >50.0 (positive result). In the sera samples recorded as positive to Anisakis allergy, Ani s 1-like was responsible for 46.4% of the sensitivity, while Ani s 7-like and Ani s 13-like for 100%. They could be considered as major antigens in the diagnosis of allergic anisakiasis caused by A. pegreffii. According to the results, iCAP is a reliable method for the detection of A. pegreffii-specific IgE during the first screening for sensitization against the parasite allergens. Our suggestion is to consider sera showing iCAP values lower than 0.35 kUA/l as truly negative, in agreement with previous suggestions; this means that these sera do not require further analysis using IgE-WB. On the other hand, the positivity of sera with higher iCAP values need to be confirmed using IgE-WB, or ELISA, employing ESP antigens rather than CE, especially in case of patients suffering allergic signs and symptoms following the consumption of fish. • Paper III: Invasive anisakiasis by the parasite Anisakis pegreffii (Nematoda: Anisakidae): diagnosis by Real-time PCR hydrolysis probe system and Immunoblotting assay. Anisakiasis is a fish-borne zoonosis caused by Anisakis spp. larvae. One challenging issue in the diagnosis of anisakiasis is the molecular detection of the etiological agent even at very low quantity, such as in gastric or intestinal biopsy and granulomas. Aims of this study were: 1) to identify three new cases of invasive anisakiasis, by a species-specific Real-time PCR probe assay; 2) to detect immune response of the patients against the pathogen. Parasite DNA was extracted from parasites removed in the three patients. The identification of larvae removed at gastric and intestinal level from two patients was first obtained by sequence analysis of mtDNA cox2 and EF1 α-1 of nDNA genes. This was not possible in the third patient, because of the very low DNA quantity obtained from a single one histological section of a surgically removed granuloma. Real-time PCR speciesspecific hydrolysis probe system, based on mtDNA cox2 gene, was performed on parasites tissue of the three cases. IgE, IgG4 and IgG immune response against antigens A. pegreffii by Immunoblotting assay was also studied. According to the mtDNA cox2 and the EF1 α−1 nDNA sequence analysis, the larvae from stomach and intestine of two patients were assigned to A. pegreffii.The Real-time PCR primers/probe system, showed a fluorescent signal at 510 nm for A. pegreffii, in all the three cases. In Immunoblotting assay, patient CC1 showed IgE, IgG4 reactivity against Ani s 13-like and Ani s 7-like; patient CC2 revealed only IgG reactivity against Ani s 13-like and Ani s 7-like; while, the third patient showed IgE and IgG reactivity against Ani s 13-like, Ani s 7-like and Ani s 1-like. The Real-time PCR assay, a more sensitive method than direct DNA sequencing for the accurate and rapid identification of etiological agent of human anisakiasis, was successfully assessed for the first time. The study also highlights the importance to use both molecular and immunological tools in the diagnosis of human anisakiasis, in order to increase our knowledge about the pathological findings and immune response related to the infection by zoonotic species of the genus Anisakis. • Paper IV: Temperature-dependent transcripts of excretory-secretory antigens of A. pegreffii larvae cultured in vitro (Nematoda: Anisakidae). Marine nematodes of the genus Anisakis are distributed in fish species and squids worldwide. Among them, A. pegreffi and A. simplex (s.s.) are known to cause the human zoonotic disease, anisakiasis. So far, in Italy, A. pegreffii is reported as causative agent of invasive and allergic anisakiasis. During all stages of their life cycle, nematodes produce and release a variety of excretory/secretory products (ESPs), which may be key players in the mechanism of parasite-host interactions. ESPs have several functions during infection, e.g. penetration of host tissues and evasion of host immune responses. They are, at the same time, known to elicit immune responses (including antibody production) both in fish and mammals. Additionally, a temperature-dependent production of ES compounds in Anisakis spp. larve has been previously suggested. The aim of the present work was to investigate a possible effect of the temperature on the expression levels of mRNA of some ES proteins considered among the antigens of the species A. pegreffii (A. peg-1, A. peg-7 and A. peg-13). Those ESPs have been described as the most important antigens responsible for IgE- sensitization in humans by A. pegreffii . To this end, freshly isolated larvae of Anisakis pegreffii were cultured in vitro at different time and temperature conditions, imitating heterothermic (intermediate/paratenic), homeothermic (natural and accidental) hosts, and at 7◦C (temperature of post-mortem larval migration in vivo). Anisakid nematodes were assigned to the species A. pegreffii on the basis of the sequences analysis of mtDNA cox2 and the EF1 α−1 nDNA region. Sequencing of A. peg-1, A. peg-7 and A. peg-13 genes were defined for the species Anisakis pegreffii. Additionally, the nucleotide sequences obtained from A. simplex (s.s.) to be compared with those from the same genes in A. pegreffii; finally, A. pegreffii and A. simplex (s.s.) sequences at those genes were compared with those previously reported, in GenBank, as A. simplex (s.l.) sequences. Quantitative real-time PCR and SDS-PAGE analysis were used to evaluate the expression levels of the A. peg-1, A. peg-7 and A. peg-13 in A. pegreffii under different temperature conditions. Quantitative RT-PCR showed that the mRNA levels of A. peg-13 increases significantly under cold shock (7 ◦C) treatment, while at 23°C and 37°C (24h, 48h) does not change significantly. The SDS-PAGE analysis showed reactivity, at 7°C after 24h, of the antigen having a relative mobility (Mr) around 37 kDa, corresponding to A. peg-13. Our results suggest that the expression of A. peg-13 (a mioglobin) may be necessary under cold stress condition. Indeed, in the literature, the mioglobin of the nematodes is known to be an adaptive protein. Differently, the A. peg-1 transcript levels under heat shock (37 ◦C) treatment, increased gradually at 24h; while it returns at normal levels after 48h. At 7°C the mRNA expression of A. peg-1did not change significantly. In addition, we found a clear time-dependent A. peg- 1 expression pattern of A. pegreffii exposed to high temperature. Our results suggest that the mRNA and protein expression patterns of A. peg-1 may be related to the temperature, and are significantly increased under heat stress. Overall, our results indicate that the expression patterns and production of ESPs by A. pegreffii larvae at 37°C reached the highest levels among all the incubation temperatures regardless. • Paper V: Anisakis pegreffii impacts differentiation and function of human dendritic cells. Human dendritic cells (DCs) show remarkably phenotypic changes when matured in presence of helminthderived products. These modifications frequently elicited a polarization towards Th2 cells and regulatory T cells thus contributing to immunological tolerance against these pathogens. In this study, the interaction between DCs and larvae of the zoonotic anisakid nematode Anisakis pegreffii was investigated. A. pegreffii larvae were collected from fish hosts and monocyte derived DCs were co-cultured in the presence of the live larvae (L) or its crude extracts (CE). In both experimental conditions A. pegreffii impacted DC viability, hampered DC maturation by reducing the expression of molecules involved in antigen presentation and migration (i.e. HLADR, CD86, CD83 and CCR7), increased the phagosomal ROS levels and modulated the phosphorylation of ERK1,2 pathway.obtained from a single one histological section of a surgically removed granuloma. Real-time PCR speciesspecific hydrolysis probe system, based on mtDNA cox2 gene, was performed on parasites tissue of the three cases. IgE, IgG4 and IgG immune response against antigens A. pegreffii by Immunoblotting assay was also studied. According to the mtDNA cox2 and the EF1 α−1 nDNA sequence analysis, the larvae from stomach and intestine of two patients were assigned to A. pegreffii.The Real-time PCR primers/probe system, showed a fluorescent signal at 510 nm for A. pegreffii, in all the three cases. In Immunoblotting assay, patient CC1 showed IgE, IgG4 reactivity against Ani s 13-like and Ani s 7-like; patient CC2 revealed only IgG reactivity against Ani s 13-like and Ani s 7-like; while, the third patient showed IgE and IgG reactivity against Ani s 13-like, Ani s 7-like and Ani s 1-like. The Real-time PCR assay, a more sensitive method than direct DNA sequencing for the accurate and rapid identification of etiological agent of human anisakiasis, was successfully assessed for the first time. The study also highlights the importance to use both molecular and immunological tools in the diagnosis of human anisakiasis, in order to increase our knowledge about the pathological findings and immune response related to the infection by zoonotic species of the genus Anisakis. • Paper IV: Temperature-dependent transcripts of excretory-secretory antigens of A. pegreffii larvae cultured in vitro (Nematoda: Anisakidae). Marine nematodes of the genus Anisakis are distributed in fish species and squids worldwide. Among them, A. pegreffi and A. simplex (s.s.) are known to cause the human zoonotic disease, anisakiasis. So far, in Italy, A. pegreffii is reported as causative agent of invasive and allergic anisakiasis. During all stages of their life cycle, nematodes produce and release a variety of excretory/secretory products (ESPs), which may be key players in the mechanism of parasite-host interactions. ESPs have several functions during infection, e.g. penetration of host tissues and evasion of host immune responses. They are, at the same time, known to elicit immune responses (including antibody production) both in fish and mammals. Additionally, a temperature-dependent production of ES compounds in Anisakis spp. larve has been previously suggested. The aim of the present work was to investigate a possible effect of the temperature on the expression levels of mRNA of some ES proteins considered among the antigens of the species A. pegreffii (A. peg-1, A. peg-7 and A. peg-13). Those ESPs have been described as the most important antigens responsible for IgE- sensitization in humans by A. pegreffii . To this end, freshly isolated larvae of Anisakis pegreffii were cultured in vitro at different time and temperature conditions, imitating heterothermic (intermediate/paratenic), homeothermic (natural and accidental) hosts, and at 7◦C (temperature of post-mortem larval migration in vivo). Anisakid nematodes were assigned to the species A. pegreffii on the basis of the sequences analysis of mtDNA cox2 and the EF1 α−1 nDNA region. Sequencing of A. peg-1, A. peg-7 and A. peg-13 genes were defined for the species Anisakis pegreffii. Additionally, the nucleotide sequences obtained from A. simplex (s.s.) to be compared with those from the same genes in A. pegreffii; finally, A. pegreffii and A. simplex (s.s.) sequences at those genes were compared with those previously reported, in GenBank, as A. simplex (s.l.) sequences. Quantitative real-time PCR and SDS-PAGE analysis were used to evaluate the expression levels of the A. peg-1, A. peg-7 and A. peg-13 in A. pegreffii under different temperature conditions. Quantitative RT-PCR showed that the mRNA levels of A. peg-13 increases significantly under cold shock (7 ◦C) treatment, while at 23°C and 37°C (24h, 48h) does not change significantly. The SDS-PAGE analysis showed reactivity, at 7°C after 24h, of the antigen having a relative mobility (Mr) around 37 kDa, corresponding to A. peg-13. Our results suggest that the expression of A. peg-13 (a mioglobin) may be necessary under cold stress condition. Indeed, in the literature, the mioglobin of the nematodes is known to be an adaptive protein. Differently, the A. peg-1 transcript levels under heat shock (37 ◦C) treatment, increased gradually at 24h; while it returns at normal levels after 48h. At 7°C the mRNA expression of A. peg-1did not change significantly. In addition, we found a clear time-dependent A. peg- 1 expression pattern of A. pegreffii exposed to high temperature. Our results suggest that the mRNA and protein expression patterns of A. peg-1 may be related to the temperature, and are significantly increased under heat stress. Overall, our results indicate that the expression patterns and production of ESPs by A. pegreffii larvae at 37°C reached the highest levels among all the incubation temperatures regardless. • Paper V: Anisakis pegreffii impacts differentiation and function of human dendritic cells. Human dendritic cells (DCs) show remarkably phenotypic changes when matured in presence of helminthderived products. These modifications frequently elicited a polarization towards Th2 cells and regulatory T cells thus contributing to immunological tolerance against these pathogens. In this study, the interaction between DCs and larvae of the zoonotic anisakid nematode Anisakis pegreffii was investigated. A. pegreffii larvae were collected from fish hosts and monocyte derived DCs were co-cultured in the presence of the live larvae (L) or its crude extracts (CE). In both experimental conditions A. pegreffii impacted DC viability, hampered DC maturation by reducing the expression of molecules involved in antigen presentation and migration (i.e. HLADR, CD86, CD83 and CCR7), increased the phagosomal ROS levels and modulated the phosphorylation of ERK1,2 pathway. These biological changes were accompanied by the impairment of DCs to activate a T cell mediated IFN. Interestingly, live larva appeared to differently modulate DC secretion of cytokines andchemokines as compared to CE. These results demonstrate for the first time the immunomodulatory role of A. pegreffi on DCs biology and functions. In addition, they suggest a dynamic contribution of DCs to the induction and maintenance of the inflammatory response against A. pegreffii.
(mainly cetaceans) as definitive hosts, while crustaceans (krill), fish and squids acting as intermediate/paratenic hosts in their life-cycles. These parasites are considered among the most important biological hazards present in “seafood” products. Indeed, larval stages of the genera Anisakis have been reported as responsible of human accidental infections (anisakiasis). Main aim of the Ph.D research project has been to add insight into the molecular and immunological mechanisms involved in the disease triggered by Anisakis spp. in the accidental host (humans). Moreover, improvement of the diagnostic tools for specific and sensible identification of etiological agent of human anisakiasis represented another aim of the Ph.D thesis. To this end, a multi-methodological approach has been carried out. Specific objectives of the project were: 1) development of a RT-PCR-Multiplex method based on species-specific primers designed to amplify sequences of the mtDNA cox2 gene, for the molecular detection of etiological agent oh human anisakidosis, even at very low quantity, such as in gastric or intestinal biopsy and granulomas removed from human cases; 2) to provide an innovative diagnostic tool based on Immunoblotting analysis for a correct serodiagnosis of allergic anisakiasis due to one of main zoonotic species (i.e. A. pegreffii) 3) analysis and characterization of the antigens considered "major allergens" in the zoonotic species A. pegreffi; 4) to evaluate the gene expression levels of A. pegreffii proteins involved in the host immunological response in relation to different temperatures and time intervals; 5) investigate the interaction between A.pegreffii - dendritic cells (DCs) involved in the human immune response. The specific aims of the Papers presented in this thesis were: • Paper I: Development of species-specific Real Time-PCR primers/probe systems to identify fish parasites of the genera Anisakis and Pseudoterranova (Nematoda: Anisakidae). We developed a primers/probe system for the identification of five species of anisakid nematodes belonging to the genera Anisakis (i.e. A. pegreffii and A. simplex (s. s.)), and other anisakid nematodes, such as Pseudoterranova decipiens (s. s.), P. krabbei and P. bulbosa (often occurring in co-infection in natural hosts) to be used in a Real time polymerase chain reaction (RT-PCR) with specific primers based on the mtDNA cox2 gene. Considering the sensibility and quantitative nature of the assays, the new primers/probe system may represent a useful tool for future basic and applied research that focuses on the identification of Anisakis spp., Pseudoterranova spp. and H. aduncum larvae in fish, even in co-infections, with a potential for application in fish farming, fish processing industries, fish markets, and food producers. • Paper II: IgE sensitization to Anisakis pegreffii in Italy: comparison of two methods for the diagnosis of allergic anisakiasis. IgE response was analyzed by immunoblotting (WB) assay, using both excretory/secretory products (ESPs) and crude extract (CE) of A. pegreffii larvae. The results were compared with those achieved by the conventional immunological method for Anisakis allergy (i.e. immunoCAP). Among the 110 subjects, 28 showed IgE positivity with both WB and iCAP methods; 13 proved IgE reactivity, in WB assay, to ESP antigens of A. pegreffii, here provisionally indicated as Ani s 1-like, Ani s 7-like, Ani s 13-like; only 15 sera have shown IgEWB reaction to Ani s 7-like and Ani s 13-like. iCAP and WB exhibited a high concordance value (k=1.00) when iCAP value was <0.35 (negative result) and >50.0 (positive result). In the sera samples recorded as positive to Anisakis allergy, Ani s 1-like was responsible for 46.4% of the sensitivity, while Ani s 7-like and Ani s 13-like for 100%. They could be considered as major antigens in the diagnosis of allergic anisakiasis caused by A. pegreffii. According to the results, iCAP is a reliable method for the detection of A. pegreffii-specific IgE during the first screening for sensitization against the parasite allergens. Our suggestion is to consider sera showing iCAP values lower than 0.35 kUA/l as truly negative, in agreement with previous suggestions; this means that these sera do not require further analysis using IgE-WB. On the other hand, the positivity of sera with higher iCAP values need to be confirmed using IgE-WB, or ELISA, employing ESP antigens rather than CE, especially in case of patients suffering allergic signs and symptoms following the consumption of fish. • Paper III: Invasive anisakiasis by the parasite Anisakis pegreffii (Nematoda: Anisakidae): diagnosis by Real-time PCR hydrolysis probe system and Immunoblotting assay. Anisakiasis is a fish-borne zoonosis caused by Anisakis spp. larvae. One challenging issue in the diagnosis of anisakiasis is the molecular detection of the etiological agent even at very low quantity, such as in gastric or intestinal biopsy and granulomas. Aims of this study were: 1) to identify three new cases of invasive anisakiasis, by a species-specific Real-time PCR probe assay; 2) to detect immune response of the patients against the pathogen. Parasite DNA was extracted from parasites removed in the three patients. The identification of larvae removed at gastric and intestinal level from two patients was first obtained by sequence analysis of mtDNA cox2 and EF1 α-1 of nDNA genes. This was not possible in the third patient, because of the very low DNA quantity obtained from a single one histological section of a surgically removed granuloma. Real-time PCR speciesspecific hydrolysis probe system, based on mtDNA cox2 gene, was performed on parasites tissue of the three cases. IgE, IgG4 and IgG immune response against antigens A. pegreffii by Immunoblotting assay was also studied. According to the mtDNA cox2 and the EF1 α−1 nDNA sequence analysis, the larvae from stomach and intestine of two patients were assigned to A. pegreffii.The Real-time PCR primers/probe system, showed a fluorescent signal at 510 nm for A. pegreffii, in all the three cases. In Immunoblotting assay, patient CC1 showed IgE, IgG4 reactivity against Ani s 13-like and Ani s 7-like; patient CC2 revealed only IgG reactivity against Ani s 13-like and Ani s 7-like; while, the third patient showed IgE and IgG reactivity against Ani s 13-like, Ani s 7-like and Ani s 1-like. The Real-time PCR assay, a more sensitive method than direct DNA sequencing for the accurate and rapid identification of etiological agent of human anisakiasis, was successfully assessed for the first time. The study also highlights the importance to use both molecular and immunological tools in the diagnosis of human anisakiasis, in order to increase our knowledge about the pathological findings and immune response related to the infection by zoonotic species of the genus Anisakis. • Paper IV: Temperature-dependent transcripts of excretory-secretory antigens of A. pegreffii larvae cultured in vitro (Nematoda: Anisakidae). Marine nematodes of the genus Anisakis are distributed in fish species and squids worldwide. Among them, A. pegreffi and A. simplex (s.s.) are known to cause the human zoonotic disease, anisakiasis. So far, in Italy, A. pegreffii is reported as causative agent of invasive and allergic anisakiasis. During all stages of their life cycle, nematodes produce and release a variety of excretory/secretory products (ESPs), which may be key players in the mechanism of parasite-host interactions. ESPs have several functions during infection, e.g. penetration of host tissues and evasion of host immune responses. They are, at the same time, known to elicit immune responses (including antibody production) both in fish and mammals. Additionally, a temperature-dependent production of ES compounds in Anisakis spp. larve has been previously suggested. The aim of the present work was to investigate a possible effect of the temperature on the expression levels of mRNA of some ES proteins considered among the antigens of the species A. pegreffii (A. peg-1, A. peg-7 and A. peg-13). Those ESPs have been described as the most important antigens responsible for IgE- sensitization in humans by A. pegreffii . To this end, freshly isolated larvae of Anisakis pegreffii were cultured in vitro at different time and temperature conditions, imitating heterothermic (intermediate/paratenic), homeothermic (natural and accidental) hosts, and at 7◦C (temperature of post-mortem larval migration in vivo). Anisakid nematodes were assigned to the species A. pegreffii on the basis of the sequences analysis of mtDNA cox2 and the EF1 α−1 nDNA region. Sequencing of A. peg-1, A. peg-7 and A. peg-13 genes were defined for the species Anisakis pegreffii. Additionally, the nucleotide sequences obtained from A. simplex (s.s.) to be compared with those from the same genes in A. pegreffii; finally, A. pegreffii and A. simplex (s.s.) sequences at those genes were compared with those previously reported, in GenBank, as A. simplex (s.l.) sequences. Quantitative real-time PCR and SDS-PAGE analysis were used to evaluate the expression levels of the A. peg-1, A. peg-7 and A. peg-13 in A. pegreffii under different temperature conditions. Quantitative RT-PCR showed that the mRNA levels of A. peg-13 increases significantly under cold shock (7 ◦C) treatment, while at 23°C and 37°C (24h, 48h) does not change significantly. The SDS-PAGE analysis showed reactivity, at 7°C after 24h, of the antigen having a relative mobility (Mr) around 37 kDa, corresponding to A. peg-13. Our results suggest that the expression of A. peg-13 (a mioglobin) may be necessary under cold stress condition. Indeed, in the literature, the mioglobin of the nematodes is known to be an adaptive protein. Differently, the A. peg-1 transcript levels under heat shock (37 ◦C) treatment, increased gradually at 24h; while it returns at normal levels after 48h. At 7°C the mRNA expression of A. peg-1did not change significantly. In addition, we found a clear time-dependent A. peg- 1 expression pattern of A. pegreffii exposed to high temperature. Our results suggest that the mRNA and protein expression patterns of A. peg-1 may be related to the temperature, and are significantly increased under heat stress. Overall, our results indicate that the expression patterns and production of ESPs by A. pegreffii larvae at 37°C reached the highest levels among all the incubation temperatures regardless. • Paper V: Anisakis pegreffii impacts differentiation and function of human dendritic cells. Human dendritic cells (DCs) show remarkably phenotypic changes when matured in presence of helminthderived products. These modifications frequently elicited a polarization towards Th2 cells and regulatory T cells thus contributing to immunological tolerance against these pathogens. In this study, the interaction between DCs and larvae of the zoonotic anisakid nematode Anisakis pegreffii was investigated. A. pegreffii larvae were collected from fish hosts and monocyte derived DCs were co-cultured in the presence of the live larvae (L) or its crude extracts (CE). In both experimental conditions A. pegreffii impacted DC viability, hampered DC maturation by reducing the expression of molecules involved in antigen presentation and migration (i.e. HLADR, CD86, CD83 and CCR7), increased the phagosomal ROS levels and modulated the phosphorylation of ERK1,2 pathway.obtained from a single one histological section of a surgically removed granuloma. Real-time PCR speciesspecific hydrolysis probe system, based on mtDNA cox2 gene, was performed on parasites tissue of the three cases. IgE, IgG4 and IgG immune response against antigens A. pegreffii by Immunoblotting assay was also studied. According to the mtDNA cox2 and the EF1 α−1 nDNA sequence analysis, the larvae from stomach and intestine of two patients were assigned to A. pegreffii.The Real-time PCR primers/probe system, showed a fluorescent signal at 510 nm for A. pegreffii, in all the three cases. In Immunoblotting assay, patient CC1 showed IgE, IgG4 reactivity against Ani s 13-like and Ani s 7-like; patient CC2 revealed only IgG reactivity against Ani s 13-like and Ani s 7-like; while, the third patient showed IgE and IgG reactivity against Ani s 13-like, Ani s 7-like and Ani s 1-like. The Real-time PCR assay, a more sensitive method than direct DNA sequencing for the accurate and rapid identification of etiological agent of human anisakiasis, was successfully assessed for the first time. The study also highlights the importance to use both molecular and immunological tools in the diagnosis of human anisakiasis, in order to increase our knowledge about the pathological findings and immune response related to the infection by zoonotic species of the genus Anisakis. • Paper IV: Temperature-dependent transcripts of excretory-secretory antigens of A. pegreffii larvae cultured in vitro (Nematoda: Anisakidae). Marine nematodes of the genus Anisakis are distributed in fish species and squids worldwide. Among them, A. pegreffi and A. simplex (s.s.) are known to cause the human zoonotic disease, anisakiasis. So far, in Italy, A. pegreffii is reported as causative agent of invasive and allergic anisakiasis. During all stages of their life cycle, nematodes produce and release a variety of excretory/secretory products (ESPs), which may be key players in the mechanism of parasite-host interactions. ESPs have several functions during infection, e.g. penetration of host tissues and evasion of host immune responses. They are, at the same time, known to elicit immune responses (including antibody production) both in fish and mammals. Additionally, a temperature-dependent production of ES compounds in Anisakis spp. larve has been previously suggested. The aim of the present work was to investigate a possible effect of the temperature on the expression levels of mRNA of some ES proteins considered among the antigens of the species A. pegreffii (A. peg-1, A. peg-7 and A. peg-13). Those ESPs have been described as the most important antigens responsible for IgE- sensitization in humans by A. pegreffii . To this end, freshly isolated larvae of Anisakis pegreffii were cultured in vitro at different time and temperature conditions, imitating heterothermic (intermediate/paratenic), homeothermic (natural and accidental) hosts, and at 7◦C (temperature of post-mortem larval migration in vivo). Anisakid nematodes were assigned to the species A. pegreffii on the basis of the sequences analysis of mtDNA cox2 and the EF1 α−1 nDNA region. Sequencing of A. peg-1, A. peg-7 and A. peg-13 genes were defined for the species Anisakis pegreffii. Additionally, the nucleotide sequences obtained from A. simplex (s.s.) to be compared with those from the same genes in A. pegreffii; finally, A. pegreffii and A. simplex (s.s.) sequences at those genes were compared with those previously reported, in GenBank, as A. simplex (s.l.) sequences. Quantitative real-time PCR and SDS-PAGE analysis were used to evaluate the expression levels of the A. peg-1, A. peg-7 and A. peg-13 in A. pegreffii under different temperature conditions. Quantitative RT-PCR showed that the mRNA levels of A. peg-13 increases significantly under cold shock (7 ◦C) treatment, while at 23°C and 37°C (24h, 48h) does not change significantly. The SDS-PAGE analysis showed reactivity, at 7°C after 24h, of the antigen having a relative mobility (Mr) around 37 kDa, corresponding to A. peg-13. Our results suggest that the expression of A. peg-13 (a mioglobin) may be necessary under cold stress condition. Indeed, in the literature, the mioglobin of the nematodes is known to be an adaptive protein. Differently, the A. peg-1 transcript levels under heat shock (37 ◦C) treatment, increased gradually at 24h; while it returns at normal levels after 48h. At 7°C the mRNA expression of A. peg-1did not change significantly. In addition, we found a clear time-dependent A. peg- 1 expression pattern of A. pegreffii exposed to high temperature. Our results suggest that the mRNA and protein expression patterns of A. peg-1 may be related to the temperature, and are significantly increased under heat stress. Overall, our results indicate that the expression patterns and production of ESPs by A. pegreffii larvae at 37°C reached the highest levels among all the incubation temperatures regardless. • Paper V: Anisakis pegreffii impacts differentiation and function of human dendritic cells. Human dendritic cells (DCs) show remarkably phenotypic changes when matured in presence of helminthderived products. These modifications frequently elicited a polarization towards Th2 cells and regulatory T cells thus contributing to immunological tolerance against these pathogens. In this study, the interaction between DCs and larvae of the zoonotic anisakid nematode Anisakis pegreffii was investigated. A. pegreffii larvae were collected from fish hosts and monocyte derived DCs were co-cultured in the presence of the live larvae (L) or its crude extracts (CE). In both experimental conditions A. pegreffii impacted DC viability, hampered DC maturation by reducing the expression of molecules involved in antigen presentation and migration (i.e. HLADR, CD86, CD83 and CCR7), increased the phagosomal ROS levels and modulated the phosphorylation of ERK1,2 pathway. These biological changes were accompanied by the impairment of DCs to activate a T cell mediated IFN. Interestingly, live larva appeared to differently modulate DC secretion of cytokines andchemokines as compared to CE. These results demonstrate for the first time the immunomodulatory role of A. pegreffi on DCs biology and functions. In addition, they suggest a dynamic contribution of DCs to the induction and maintenance of the inflammatory response against A. pegreffii.
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Dottorato di ricerca in Ecologia e gestione sostenibile delle risorse ambientali
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