Development of a novel nanotechnological approach for the treatment of medulloblastoma
Author(s)
Marchetti, Luca
Date Issued
July 19, 2023
Type
Doctoral Thesis
Abstract
Medulloblastoma (MB) is a primary tumor of the cerebellum that mainly affects children. Conventional therapies, particularly for the Sonic hedgehog (SHH) tumor subtype, which is prevalent in infants, are limited due to severe neurological side effects and the impracticality of radiotherapy related to the young age of the patients. In this study, we propose an innovative solution that utilizes plant virus nanoparticles as a targeted drug delivery system. Specifically, the study focuses on the Tomato bushy stunt virus (TBSV) and its potential as a vehicle for chemotherapeutic agents delivery. To this end, the surface of TBSV nanoparticles has been genetically engineered with peptides known to be specific towards tumor cells. Large-scale production of these modified particles has been achieved using Nicotiana benthamiana plants. In vitro experiments on primary SHH-MB cell cultures have identified highly efficient peptides capable of facilitating specific entry of TBSV nanoparticles into brain tumor cells. Immunofluorescence and molecular dynamics analyses have provided evidence supporting the interaction between peptides and their natural partners, confirming the specific targeting of selected viral nanoparticles. Furthermore, it has been observed that the administration of doxorubicin (DOX) through TBSV chimeric nanoparticles allows for a reduced dosage of the chemotherapeutic agent needed to significantly decrease the viability of tumor cells. Systemic administration of functionalized TBSV nanoparticles in MB-affected mice has confirmed the virus's ability to specifically reach the tumor. In particular, functionalization of TBSV nanoparticles with the CooP peptide has been found to be the most effective combination for tumor targeting. Preclinical study results demonstrate that when DOX is encapsulated within TBSV-CooP nanoparticles, its effects on cell proliferation and death are similar to those obtained with a five times higher dose of non-encapsulated DOX, both in early and advanced stages of tumor development, without any observable side-effect. These results highlight the potential of TBSV as a promising vehicle for targeted chemotherapy delivery in the treatment of medulloblastoma. Using the same genetic engineering strategy, we also report the development of a TBSV nanoparticle functionalized with a specific peptide called C-end rule RPARPAR (RPAR), for the specific targeting of neuropilin-1 (NRP-1), a receptor commonly expressed in various tumor types. Flow cytometry and confocal microscopy have demonstrated specific binding and high internalization of TBSV-RPAR nanoparticles in cells expressing the NRP-1 receptor. Furthermore, when loaded with DOX, TBSV-RPAR particles have shown selective cytotoxicity only towards cells expressing NRP-1. Overall, these results demonstrate the feasibility and precision of the TBSV platform for targeted delivery of pharmacological molecules to specific target sites.
Il medulloblastoma (MB) è un tumore primario del cervelletto che colpisce principalmente i bambini. Le terapie convenzionali, in particolare per il sottotipo tumorale Sonic hedgehog (SHH) che è prevalente nei neonati, sono limitate a causa dei gravi effetti collaterali neurologici e dell'inapplicabilità della radioterapia legati alla giovane età dei pazienti. In questo studio, proponiamo una soluzione innovativa che utilizza le nanoparticelle di virus vegetali come sistema per la somministrazione mirata di farmaci. In particolare, lo studio si focalizza sul virus del rachitismo cespuglioso del pomodoro (TBSV) e sul suo potenziale come veicolo per la somministrazione di chemioterapici. A tale proposito la superficie delle nanoparticelle di TBSV è stata ingegnerizzata geneticamente con peptidi noti per la loro specificità nei confronti delle cellule tumorali. La produzione su larga scala di queste particelle modificate è stata ottenuta utilizzando piante di Nicotiana benthamiana. Gli esperimenti in vitro su colture primarie di cellule di SHH-MB hanno permesso di identificare dei peptidi altamente efficienti, capaci di facilitare l’ingresso specifico delle nanoparticelle di TBSV all’interno delle cellle tumorali cerebrali. Analisi di immunofluorescenza e di dinamica molecolare hanno fornito prove a sostegno dell'interazione tra i peptidi e i loro partner naturali, confermando il targeting specificoin particolare di alcune delle nanoparticelle virali selezionate. Inoltre, è stato osservato che la somministrazione di doxorubicina (DOX) attraverso le nanoparticelle chimeriche di TBSV consente di ridurre la dose del chemioterapico necessaria per diminuire in modo significativo la vitalità delle cellule tumorali. La somministrazione sistemica delle nanoparticelle di TBSV funzionalizzate, in topi affetti da MB, ha confermato la capacità del virus di raggiungere il tumore in modo specifico. In particolare, la funzionalizzazione delle nanoparticelle di TBSV con il peptide CooP è risultata essere la combinazione che meglio riconosce il bersaglio tumorale. Infatti i risultati derivati dallo studio preclinico dimostrano che quando DOX è incapsulata all’interno delle nanoparticelle di TBSV-CooP, i suoi effetti sulla proliferazione e sulla morte cellulare sono simili a quelli ottenuti con una dose cinque volte superiore di DOX non incapsulata, sia nelle fasi precoci che nelle fasi avanzate dello sviluppo tumorale, e in assenza di effetti collaterali sistemici. Questi risultati evidenziano il potenziale del TBSV come promettente veicolo per la somministrazione mirata di chemioterapici per il trattamento del medulloblastoma. Con la stessa strategia di ingegneria genetica riportiamo, inoltre, lo sviluppo di una nanoparticella di TBSV funzionalizzata con un peptide particolare definito C-end rule RPARPAR (RPAR), per il targeting specifico della neuropilina-1 (NRP-1), recettore comunemente espresso in diverti stipi di tumori. La citometria a flusso e la microscopia confocale hanno dimostrato il legame specifico e un elevato grado di internalizzazione delle nanoparticelle di TBSV-RPAR nelle cellule che esprimono il recettore NRP-1. Inoltre, quando caricate con DOX le particelle di TBSV-RPAR hanno mostrato una citotossicità selettiva solamente per le cellule che esprimono NRP-1. Nel complesso, questi risultati dimostrano la fattibilità e la precisione della piattaforma TBSV per la consegna mirata di molecole farmacologiche in siti target specifici.
Additional information
Dottorato di ricerca in Scienze delle produzioni vegetali e animali
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