Valutazione del rischio da esposizione a radiazioni ionizzanti: studio della trasmissione ereditaria di aumentata suscettibilità al cancro in un modello murino sensibile
Author(s)
Paris, Lorena
Date Issued
May 16, 2014
Type
Doctoral Thesis
Abstract
Recentemente, sono state ottenute nuove dimostrazioni a favore degli effetti non-target e a lungo
termine delle radiazioni ionizzanti; tali effetti includono l’instabilità genomica nelle cellule
discendenti da cellule irraggiate, come anche cambiamenti in cellule non irraggiate in seguito ad
una segnalazione da parte di cellule irraggiate. Queste osservazioni hanno permesso di riconsiderare
l’ipotesi della cancerogenesi transgenerazionale radio-indotta. Secondo tale ipotesi, la progenie di
genitori irraggiati (in particolare i padri) potrebbe avere un’aumentata suscettibilità al cancro.
Finora, in tale ambito, sono disponibili dati contrastanti provenienti da esperimenti con animali e da
studi epidemiologici umani. Quando si manifesta un’aumentata suscettibilità allo sviluppo tumorale
la frequenza di progenie affetta non è confrontabile con i tassi di mutazione radio-indotti, ma dei
meccanismi alternativi per spiegare tale fenomeno non sono ancora stati chiariti. Con il progresso
nelle terapie anti-cancro, un’alta percentuale di individui può avere aspettative di vita maggiori e
chiedere una consulenza genetica. A causa del limitato potere statistico degli studi epidemiologici
umani, si rendono necessari esperimenti con modelli murini altamente sensibili e ben caratterizzati
al fine di ottenere dati che possano contribuire ad una stima di rischio nella progenie di padri
irraggiati.
In questo progetto di dottorato è stato condotto uno studio mirato a validare l’ipotesi di
cancerogenesi transgenerazionale in topi mutanti per il gene Ptch1, caratterizzati da un’elevata
radio-sensibilità e da una predisposizione allo sviluppo tumorale (in particolare nel cervelletto, nella
pelle e nel muscolo scheletrico). Al fine di verificare l’ipotesi che la cancerogenesi
transgenerazionale possa essere indotta dall’irraggiamento degli spermatogoni in differenziamento,
topi maschi wild type sono stati irraggiati con 1 Gy di raggi X, 42 giorni prima dell’accoppiamento
con femmine Ptch1+/- non irraggiate. La loro progenie Ptch1+/- è stata oggetto di studio ai fini della
valutazione dell’incidenza spontanea e radio-indotta (1 Gy di raggi X) di medulloblastoma.
L’irraggiamento della progenie è stato effettuato a 2 giorni di vita, poiché tale periodo rappresenta
una ben caratterizzata finestra temporale di radio-sensibilità nel cervelletto. Oltre allo studio di
cancerogenesi transgenerazionale, sono stati valutati, con il test della cometa, gli effetti delle
radiazioni negli spermatozoi dei topi parentali (P) irraggiati. Non sono state rilevate differenze nei
livelli di danno al DNA tra topi P irraggiati e non irraggiati, suggerendo che gli spermatozoi
discendenti dagli spermatogoni irraggiati non trasmettono danni al DNA alle generazioni
successive.
L’incidenza tumorale è stata confrontata con le incidenze spontanee e radio-indotte nella progenie
di padri non irraggiati. E’ stato osservato un significativo aumento (borderline) dell’incidenza di
medulloblastoma indotto dall’irraggiamento neonatale nella progenie di padri irraggiati, mentre
l’incidenza tumorale spontanea non è influenzata dall’irraggiamento paterno. L’analisi effettuata
con il test della cometa ha dimostrato che le cellule di cervelletto della progenie di padri irraggiati
non manifestano un danno al DNA maggiore o una minore efficienza dei sistemi di riparazione
rispetto alla progenie di padri non irraggiati. Analogamente, effettuando test della cometa e del
micronucleo, non sono stati riscontrati eventi di instabilità genomica transgenerazionale spontanea o
radio-indotta in cellule di midollo osseo e milza della progenie F1 adulta.
Inoltre, mediante l’analisi LOH di tutti i tumori, è stato possibile escludere un meccanismo
epigenetico di inattivazione dell’allele Ptch1 wild type come causa dell’aumentata incidenza
tumorale nella progenie di padri irraggiati. Infine, è stata dimostrata un’alterazione nell’equilibrio
del pathway di proliferazione/differenziamento nelle lesioni preneoplastiche della progenie di padri
irraggiati. Tale evidenza suggerisce che l’eredità dell’irraggiamento paterno potrebbe consistere in
una variazione, modulata epigeneticamente, dell’espressione di geni che promuovono la
proliferazione dello strato granulare esterno del cervelletto neonatale rendendolo più sensibile alla
cancerogenesi radio-indotta. Sono stati programmati studi volti a caratterizzare i messaggeri
molecolari dell’ereditarietà epigenetica negli spermatozoi dei padri irraggiati.
Recently, new evidence has been obtained on untargeted and delayed effects of ionising radiation.
They include genomic instability in the daughters of irradiated cells and changes in non-irradiated
cells as a result of signals from irradiated cells. These results have given impulse to reconsider the
hypothesis of radiation-induced transgenerational carcinogenesis. According to this hypothesis, the
offspring of irradiated parents (particularly fathers) could have an increased cancer susceptibility.
So far, conflicting results on this issue have been collected by experiments in rodents and human
epidemiological studies. When a phenotype of cancer susceptibility was shown, the frequency of
affected offspring was not compatible with radiation-induced mutation rates, but alternative
mechanisms were not demonstrated. With advances in therapy, a high percentage of young adults
diagnosed with cancer can expect to be long term survivors and ask for genetic counselling.
Because of the limited statistical power of human epidemiological studies, experiments with well
characterised, highly sensitive mouse models are necessary to obtain the data to assess cancer risk
in the progeny of irradiated fathers.
Here we report a study aimed at rigorously testing the hypothesis of transgenerational
carcinogenesis in Ptch1 heterozygous knockout mice, characterised by high radiation sensitivity and
tumour predisposition, particularly in the brain, skin and soft tissues. To test the hypothesis of
transgenerational carcinogenesis induced by irradiation of differentiating spermatogonia, Ptch1 wild
type mice were irradiated with 1 Gy X-rays and mated 42 days later with unirradiated Ptch1+/-
females. Their Ptch1+/- progeny was tested for the spontaneous incidence of medulloblastoma and
for the incidence of tumors induced by irradiation (1 Gy) at postnatal day 2, a well-characterized
window of cerebellum radiation sensitivity.
In addition to the transgenerational carcinogenicity study, radiation effects in the sperm of P
irradiated mice were assessed by the application of comet assay. No difference was shown on the
sperm DNA damage level between irradiated and unirradiated mice, showing that sperm descendant
from irradiated spermatogonia did not transmit unstable DNA lesions to the next generation.
In comparison to the spontaneous and radiation-induced tumour incidence in control groups of mice
born from unirradiated fathers, we showed a borderline significant increase of tumours induced by
neonatal irradiation in the progeny of irradiated fathers, whereas the spontaneous tumour incidence
was unaffected by paternal irradiation. By comet test we excluded that cerebellar cells of the
offspring of irradiated fathers suffered more radiation-induced DNA damage or were impaired in
DNA repair. Similarly, no evidence of spontaneous or radiation induced transgenerational genomic
instability was shown by comet and micronucleus tests in bone marrow and spleen cells of the adult
F1 progeny of irradiated mice.
By LOH analysis of all tumours, we ruled out epigenetic inactivation of the Ptch1 wild type allele
as a driver of the increased tumour incidence in the progeny of irradiated fathers.
Finally, we demonstrated a switch between proliferating/differentiating pathways in the
preneoplastic lesions of the offspring of irradiated fathers. This suggested that the paternal
irradiation legacy consisted in an epigenetically modulated shift of gene expression promoting
proliferation of the external granular layer of neonatal cerebellum, which could make it more
sensitive to radiation-induced carcinogenicity. Studies are in progress to characterize the
Additional information
Dottorato di ricerca in Evoluzione biologica e biochimica
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