Production of tumour-targeting antibodies in hairy root cultures
Author(s)
Lonoce, Chiara
Date Issued
December 11, 2017
Type
Doctoral Thesis
Abstract
Large-scale production of biopharmaceuticals using traditional systems, such as yeast,
bacteria or CHO cells, present some limits in particular due to the high costs and biosafety
issues. In the past twenty years a new production platform for biopharmaceuticals has
been developed exploiting plant cells known as plant molecular farming. The use of whole
plants as well as plant cells or tissue cultures have several advantages such as their
intrinsic biosafety for the absence of human pathogens, the possibility of accumulating a
large biomass, the secretion of the protein in the culture medium (easing the downstream
purification processes) and the reduced production costs. In this context, hairy root
cultures (HRs) represent an ideal platform for the production of heterologous proteins for
their rapid growth under contained conditions in bioreactors and for the possibility of
secreting the molecule of interest in the culture medium. The aim of the PhD project is to
obtain Nicotiana tabacum or Nicotiana benthamiana hairy roots expressing two tumourtargeting
antibodies and set up a protocol for the secretion of these antibodies in the
culture medium. Moreover, we devised a novel strategy to obtain recombinant antibodies
with a human compatible glycosylation pattern necessary for their use in tumour therapy.
To this aim hairy roots clones expressing two tumour-targeting antibodies, the mAb H10
against the Tenascin-C tumour marker expressed in several cancer diseases (e.g. breast
cancer, lung cancer, glioblastoma) and the recombinant 2B8-FcΔXTFT antibody against
the CD20 antigen for the treatment of non-Hodgkin lymphomas were obtained from
Nicotiana tabacum and the ΔXTFT Nicotiana benthamiana glyco-modified plant. Selected
HR clones accumulated the mAb H10 in the culture medium with yields ranging from 2 to 3
mg/L. N. tabacum-derived mAb H10 beared plant-typical complex glycan structures while
the one produced in ΔXTFT N. benthamiana showed mostly GnGn structures lacking
xylose and fucose residues. Both antibodies exhibited comparable antigen binding
activities and could be efficiently secreted in the culture medium and purified using a
single-step affinity chromatography protocol. In the case of the anti-CD20 2B8-FcΔXTFT,
HRs expressing the recombinant antibody were obtained from the glyco-modified ΔXTFT
Nicotiana benthamiana. Also in this case, the recombinant molecule accumulated in the
culture medium at levels of about 8 mg/L. N-glycosylation profiles of 2B8-FcΔXTFT
revealed GnGn structures lacking xylose and fucose and the antibody exhibited CD20
antigen-binding activities comparable to the same molecule produced in agroinfiltrated N.
benthamiana leaves. These results show that HRs are an efficient and promising platform
for the production of tumour-targeting antibodies with optimized glycosylation pattern to be
used in therapy and diagnosis representing a valid alternative to traditional expression
systems. Indeed, the secretion of heterologous proteins in the culture medium can vary
among the different HR clones and the protocol used to induce the secretion of proteins
can have a profound impact on the final yield. With the aim of improving our knowledge on
the secretion process of heterologous proteins in HRs and to further optimize the protocols
used for secretion we generated HRs expressing a secretory version of the red fluorescent
protein (RFP). Different auxins were tested at different concentrations and results showed
that the 2,4-D at 0.1 mg/L, improved the secretion allowing a higher accumulation of RFP
in the liquid culture medium reaching the very high levels of ~ 350 mg/L. In addition, to
prove the efficacy of 2,4-D in the accumulation of molecules of interest in HR culture
medium, we evaluated the secretion of the tumour-targeting 2B8-FcΔXTFT from
transgenic ΔXTFT N. benthamiana hairy roots reaching the highest levels reported of 16.3
mg/L. To conclude we demonstrated that hairy roots are a valid platform for the production
of glyco-optimized tumour-targeting antibodies and hairy roots expressing RFP are a valid
model system to improve and study heterologous protein secretion. Future efforts need to
be focused on devising further improved induction protocols to enhance protein secretion
from roots in order to transform HRs into a more competitive system for heterologous
protein production.
La produzione su larga scala di biofarmaci utilizzando sistemi tradizionali, come lieviti,
batteri o cellule CHO, presenta alcuni limiti in particolare legati agli elevati costi e alla
biosicurezza. Negli ultimi vent'anni è stata sviluppata una nuova piattaforma per la
produzione di biofarmaci che sfrutta le cellule vegetali. Questa tecnica è conosciuta come
Plant Molecular Farming (PMF). L'uso di piante (intere), cellule vegetali o colture di tessuti
presenta diversi vantaggi come la loro intrinseca biosicurezza per l'assenza di agenti
patogeni umani, la possibilità di accumulare una grande biomassa, la secrezione della
proteina nel mezzo di coltura (facilitando la purificazione a valle) e i costi di produzione
ridotti. In questo contesto, le hairy root (HR) rappresentano una piattaforma ideale per la
produzione di proteine eterologhe per la loro rapida crescita in condizioni sterili e per la
possibilità di secernere la molecola di interesse nel terreno di coltura. Lo scopo del
progetto di dottorato è di ottenere hairy root di Nicotiana tabacum o di Nicotiana
benthamiana che esprimono due anticorpi anti-tumorali e mettere a punto un protocollo
per la secrezione di questi anticorpi nel terreno di coltura. Inoltre, abbiamo escogitato una
nuova strategia per ottenere anticorpi ricombinanti con un modello di glicosilazione
compatibile con l'uomo necessario per il loro uso nella terapia anti-tumorale. A questo
scopo, sono stati generate cloni di hairy root che esprimono due anticorpi anti-tumorali, il
mAb H10 che lega la Tenascina espressa in diversi tumori (es. Cancro al seno, cancro del
polmone, glioblastoma) e l'anticorpo ricombinante 2B8-FcΔXTFT che lega l'antigene CD20
usato per il trattamento dei linfomi non Hodgkin. I cloni selezionati hanno accumulato il
mAb H10 nel terreno di coltura con rese che vanno da 2 a 3 mg / L. Il mAb H10 derivato
da N. tabacum era caratterizzato da complesse strutture glicaniche tipiche delle piante,
mentre quello prodotto in ΔXTFT N. benthamiana mostrava principalmente strutture GnGn
prive di xilosio e residui di fucosio. Entrambi gli anticorpi mostravano attività di legame
all’antigene comparabili e potevano essere efficientemente secreti nel mezzo di coltura e
purificati usando un protocollo cromatografico di affinità a singolo stadio. Nel caso dell'anti-
CD20 2B8-FcΔXTFT, le HR che esprimono l'anticorpo ricombinante sono state ottenute
dal ΔXTFT Nicotiana benthamiana glico-modificate. Anche in questo caso, la molecola
ricombinante accumulata nel mezzo di coltura a livelli di circa 8 mg/L. Profili di Nglicosilazione
di 2B8-FcΔXTFT hanno rivelato la presenza di strutture GnGn prive di
xilosio e fucosio e l'anticorpo mostra attività di legame all'antigene CD20 paragonabili alla
stessa molecola prodotta in foglie di N. benthamiana agroinfiltrate. Inoltre, la secrezione di
proteine eterologhe nel mezzo di coltura può variare tra i diversi cloni di HR e il protocollo
usato per indurre la secrezione di proteine può avere un profondo impatto sul rendimento
finale. Con l'obiettivo di migliorare le nostre conoscenze sul processo di secrezione delle
proteine eterologhe nelle HR e di ottimizzare ulteriormente i protocolli usati per la
secrezione, abbiamo generato HR che esprimono una versione secretoria della proteina
fluorescente nel rosso (RFP). Diverse auxine sono state testate a diverse concentrazioni e
i risultati hanno mostrato che il 2,4-D a 0,1 mg/ L, consentendo un più alto accumulo di
RFP nel mezzo di coltura raggiungendo i livelli molto elevati di 350 mg/ L. Inoltre, per
dimostrare l'efficacia di 2,4-D nell'accumulo di molecole di interesse nel terreno di coltura,
abbiamo valutato la secrezione del 2B8-FcΔXTFT raggiungendo i livelli più elevati riportati
di 16,3 mg/ L. Per concludere abbiamo dimostrato che le HR sono una valida piattaforma
per la produzione di anticorpi anti-tumorali e le HR che esprimono RFP sono un valido
sistema modello per migliorare e studiare la secrezione di proteine eterologhe. I futuri
sforzi devono essere focalizzati sull'elaborazione di ulteriori protocolli di induzione per
migliorare la secrezione al fine di ottenere un sistema sempre più competitivo per la
produzione di proteine eterologhe.
Additional information
Dottorato di ricerca in Scienze delle produzioni vegetali e animali
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