Exploring novel green, high-tech and molecular mechanisms for the control and early detection of Fusarium head blight in durum wheat
Author(s)
Francesconi, Sara
Date Issued
July 21, 2021
Type
Doctoral Thesis
Abstract
Wheat is the world’s most economically important cereal crop, grown across millions of hectares. Fusarium head blight (FHB) disease is considered a major threat to durum (Triticum turgidum subsp. durum (Desfontaines) Husnache) and bread wheat (T. aestivum L.) and Fusarium graminearum is the most damaging FHB pathogen. Infection is linked to host anthesis, and symptoms include necrosis, bleaching of heads and shrivelled kernels. FHB is mainly managed by the application of fungicides at anthesis. Nevertheless, no fully effective fungicides are available for FHB control, so utilization of other mitigation measures, such as the use of resistant cultivars, is necessary for FHB management. Resistance to FHB is quantitative and multigenic and five components of resistance (type I, II, III, IV and V) have been described. The main problem in testing for FHB resistance is reproducibility, so necessary tools for breeding resistant cultivars are reliable inoculation methods and the testing for different FHB-associated characteristics. In the first part of the work, we screened three Italian wheat genotypes, Palesio, Claudio and Marco Aurelio, for type I, type II, and, in part, for type V resistances, with both phenotypic (% of disease incidence and severity, thousand kernel weight (TKW) and molecular (quantification of fungal biomass with Real-Time qPCR) approaches, using spray and point inoculation protocols. Results underlined that Palesio bread wheat showed type I tolerance to initial infection, and Marco Aurelio durum wheat showed an important type II resistance to disease spread when spray-inoculated (27% disease severity). Quantification of fungal biomass showed that differentiation among the three wheat cultivars was best visualized when spray inoculation was used. TKW data showed that % yield loss was greater after point inoculations, except in Marco Aurelio, which was not affected by inoculation method. This study has highlighted the complexity of testing for FHB resistance, and demonstrated the necessity to use as many resistance screening protocols as possible.
Several evidences shown that stomatal closure is involved in the first line of defence against plant pathogens. However, there is very little evidence to show that photosynthetic parameters change in inoculated plants. The aim of the second part of the research was to study the role of stomatal regulation in wheat after F. graminearum inoculation and explore its possible involvement in FHB resistance. RT-qPCR revealed that genes involved in stomatal regulation are induced in the resistant Sumai3 cultivar but not in the susceptible Rebelde cultivar. Seven genes involved in the positive regulation of stomatal closure were up-regulated in Sumai3, but it is most likely, that two genes, TaBG and TaCYP450, involved in the negative regulation of stomatal closure, were strongly induced, suggesting that FHB response is linked to cross-talk between the genes promoting and inhibiting stomatal closure. Increasing temperature of spikes in the wheat genotypes and a decrease in
photosynthetic efficiency in Rebelde but not in Sumai3, were observed, confirming the hypothesis that photosynthetic parameters are related to FHB resistance.
The application timing of chemicals to control FHB is not optimized. In fact, fungicides are applied when FHB symptoms are clearly visible and the spikes are almost entirely bleached (% of diseased spikelets > 80%), by when it is too late to control FHB disease. For this reason, farmers usually perform repeated fungicide treatments, causing a waste of money and posing significant risks to the environment and non-target organisms. In the third part of the study, we used unmanned aerial vehicle (UAV)-based thermal infrared (TIR) and red-green-blue (RGB) imaging to early detect FHB in T. turgidum (cv. Marco Aurelio) under natural field conditions. TIR and RGB data correlated with ground-based measurements such as spike’s temperature, photosynthetic efficiency and molecular identification of FHB pathogens, demonstrating that these high-throughput phenotyping methodologies were able to early detect FHB at anthesis half-way (Zadoks stage 65, ZS 65), when the % of diseased spikelets ranged between 20% and 60%. Moreover, in greenhouse experiments the transcripts of the key genes involved in stomatal closure were mostly up-regulated in F. graminearum-inoculated plants, demonstrating that the physiological mechanism behind the spike’s temperature increase and photosynthetic efficiency decrease could be attributed to the closure of the guard cells in response to F. graminearum. In addition, preliminary analysis revealed that there is differential regulation of genes between drought-stressed and F. graminearum-inoculated plants, suggesting that there might be a possibility to discriminate between water stress and FHB infection. This study shows the potential of UAV-based TIR and RGB imaging for field phenotyping of wheat and other cereal crop species in response to environmental stresses. This is anticipated to have enormous promise for the early detection of FHB disease, especially when combined with molecular diagnostics, and tremendous implications for optimizing the application of fungicides, since global food crop demand is to be met with minimal environmental impacts.
A consistent related issue linked to the use of conventional fungicides regards the fact that they accumulate in the soil and are dangerous for animal and human health. This fourth part of the study assayed the antifungal ability of chitosan hydrochloride against Fusarium graminearum. Chitosan reduced F. graminearum growth and downregulated the transcript of the major genes involved in the cell growth, respiration, virulence, and trichothecenes biosynthesis. Chitosan promoted the germination rate, the root and coleoptile development, and the nitrogen balance index in two durum wheat genotypes, Marco Aurelio (FHB-susceptible) and DBC480 (FHB-resistant). Chitosan reduced FHB severity when applied on spikes or on the flag leaves. FHB severity in DBC480 was of 6% at 21 dpi after chitosan treatments compared to F. graminearum inoculated control (20%). The elicitor-like property of chitosan was confirmed by the up-regulation of TaPAL, TaPR1 and TaPR2 (around
3-fold). Chitosan decreased the fungal spread and mycotoxins accumulation. This study demonstrated that the non-toxic chitosan is a powerful molecule with the potential to replace the conventional fungicides. The combination of a moderately resistant genotype (DBC480) with a sustainable compound (chitosan) will open new frontiers for the reduction of conventional compounds in agriculture.
Il frumento è il cereale economicamente più importante del mondo, coltivato su milioni di ettari. La Fusariosi della spiga è considerata una grave minaccia per il frumento duro (Triticum turgidum subsp. durum (Desfontaines) Husnache) e il frumento tenero (T. aestivum L.) e Fusarium graminearum è l’agente causale più dannoso. L'infezione è collegata all'antesi dell'ospite e i sintomi includono necrosi, sbiancamento delle spighe e avvizzimento della granella. La Fusariosi è principalmente gestita dall'applicazione di fungicidi durante l’antesi. Tuttavia, non sono disponibili fungicidi pienamente efficaci per il controllo della Fusariosi, quindi l'utilizzo di altre misure di mitigazione, come l'uso di cultivar resistenti, è necessario per la gestione della Fusariosi. La resistenza alla Fusariosi è quantitativa e multigenica e sono state descritte cinque componenti della resistenza (tipo I, II, III, IV e V). Il problema principale nei test per la resistenza alla Fusariosi è la riproducibilità, quindi gli strumenti necessari per la cultura di cultivar resistenti sono metodi di inoculazione affidabili e il test per le diverse caratteristiche associate alla Fusariosi. Nella prima parte del lavoro sono stati vagliati tre genotipi di frumento italiano, Palesio, Claudio e Marco Aurelio, per le resistenze di tipo I, di tipo II e, in parte, di tipo V, sia fenotipiche (% di incidenza e gravità della malattia, peso dei mille semi (TKW) e molecolare (quantificazione della biomassa fungina con Real-Time qPCR), utilizzando protocolli di inoculazione spray e point. I risultati hanno evidenziato che il frumento tenero Palesio ha mostrato una tolleranza di tipo I all'infezione iniziale e il frumento duro Marco Aurelio ha mostrato un'importante resistenza di tipo II alla diffusione della malattia quando inoculato tramite la tecnica spray (27% di gravità della malattia). La quantificazione della biomassa fungina ha mostrato che la differenziazione tra le tre cultivar di frumento era meglio visualizzata quando è stata utilizzata l'inoculazione a spray. I dati TKW hanno mostrato che la % di perdita di resa era maggiore dopo inoculazioni puntuali, ad eccezione di Marco Aurelio, che non è stato influenzato dal metodo di inoculazione. Questo studio ha evidenziato la complessità dei test per la resistenza alla Fusariosi e ha dimostrato la necessità di utilizzare il maggior numero possibile di protocolli di screening della resistenza.
Diverse evidenze hanno mostrato che la chiusura stomatica è coinvolta nella prima linea di difesa contro i patogeni delle piante. Tuttavia, ci sono pochissime prove a dimostrazione che i parametri fotosintetici cambiano nelle piante inoculate. Lo scopo della seconda parte della ricerca è stato quello di studiare il ruolo della regolazione stomatica nel frumento dopo l'inoculazione di F. graminearum ed esplorare il suo possibile coinvolgimento nella resistenza alla Fusariosi. La tecnica di Real-Time RT-qPCR ha rivelato che i geni coinvolti nella regolazione stomatica sono indotti nella cultivar Sumai3 resistente ma non nella cultivar Rebelde suscettibile. Sette geni coinvolti nella regolazione positiva della chiusura stomatica erano sovraespressi in Sumai3, ma è molto probabile che due geni,
TaBG e TaCYP450, coinvolti nella regolazione negativa della chiusura stomatica, fossero fortemente indotti, suggerendo che la risposta alla Fusariosi coinvolge un dialogo tra i geni che promuovono e inibiscono la chiusura stomatica. Sono stati osservati un aumento della temperatura delle spighe nei genotipi e una diminuzione dell'efficienza fotosintetica in Rebelde ma non in Sumai3, confermando l'ipotesi che i parametri fotosintetici siano correlati alla resistenza alla Fusariosi.
I tempi di applicazione delle sostanze chimiche per il controllo della Fusariosi non sono ottimizzati. Infatti, i fungicidi vengono applicati quando i sintomi della Fusariosi sono chiaramente visibili e le spighe sono quasi completamente sbiancate (% di spighette malate > 80%), quando è troppo tardi per controllare la malattia. Per questo motivo, gli agricoltori sono soliti eseguire trattamenti fungicidi ripetuti, causando uno spreco di denaro e comportando rischi significativi per l'ambiente e per gli organismi non bersaglio. Nella terza parte dello studio, abbiamo utilizzato l'imaging termico a infrarossi (TIR) e il sensore nel visibile rosso-verde-blu (RGB) basato su veicoli aerei senza pilota (UAV) per rilevare precocemente la Fusariosi della spiga in T. turgidum (cv. Marco Aurelio) in condizioni di campo. I dati TIR e RGB sono correlati con misurazioni a terra come la temperatura della spiga, l'efficienza fotosintetica e l'identificazione molecolare dei patogeni causanti la Fusariosi, dimostrando che queste metodologie di fenotipizzazione ad alto rendimento sono state in grado di rilevare precocemente la Fusariosi in pre-antesi (Zadoks stadio 65, ZS 65 ), quando la % di spighette malate variava tra il 20% e il 60%. Inoltre, negli esperimenti in serra le trascrizioni dei geni chiave coinvolti nella chiusura degli stomi sono state per lo più sovraespresse nelle piante inoculate con F. graminearum, dimostrando che il meccanismo fisiologico dietro l'aumento della temperatura della spiga e la diminuzione dell'efficienza fotosintetica potrebbe essere attribuito alla chiusura delle cellule di guardia in risposta a F. graminearum. Inoltre, l'analisi preliminare ha rivelato che esiste una regolazione differenziale dei geni tra piante stressate con siccità e piante inoculate con F. graminearum, suggerendo che potrebbe esserci la possibilità di discriminare tra stress idrico e infezione da Fusariosi. Questo studio mostra il potenziale dell'imaging TIR e RGB basato su UAV per la fenotipizzazione sul campo di frumento e altre specie di cereali in risposta a stress ambientali. Si prevede che ciò abbia enormi promesse per la diagnosi precoce della malattia da Fusariosi, specialmente se combinato con la diagnostica molecolare, e enormi implicazioni per l'ottimizzazione dell'applicazione dei fungicidi, poiché la domanda globale di colture alimentari deve essere soddisfatta con un impatto ambientale minimo.
Un problema consistente correlato all'uso dei fungicidi convenzionali riguarda il fatto che si accumulano nel terreno e sono pericolosi per la salute animale e umana. Questa quarta parte dello studio ha analizzato la capacità antimicotica del chitosano cloridrato contro Fusarium graminearum. Il chitosano ha ridotto la crescita di F. graminearum e ha inibito la trascrizione dei principali geni
coinvolti nella crescita cellulare, nella respirazione, nella virulenza e nella biosintesi dei tricoteceni. Il chitosano ha promosso il tasso di germinazione, lo sviluppo radicale e del coleottile e l'indice di bilancio azotato in due genotipi di grano duro, Marco Aurelio (suscettibile alla Fusariosi) e DBC480 (resistente alla Fusariosi). Il chitosano ha ridotto la gravità della Fusariosi quando applicato sulle spighe o sulle foglie bandiera. La gravità della Fusariosi in DBC480 era del 6% a 21 giorni dopo l’inoculo dopo il trattamento con chitosano rispetto al controllo inoculato con F. graminearum (20%). La proprietà simile all'elicitore del chitosano è stata confermata dalla sovraespressione di TaPAL, TaPR1 e TaPR2 (circa 3 volte tanto). Il chitosano ha ridotto la diffusione dei funghi e l'accumulo di micotossine. Questo studio ha dimostrato che il chitosano è una molecola potente con il potenziale per sostituire i fungicidi convenzionali. La combinazione di un genotipo moderatamente resistente (DBC480) con un composto sostenibile (chitosano) aprirà nuove frontiere per la riduzione dei composti convenzionali in agricoltura.
Additional information
Dottorato di ricerca in Scienze delle produzioni vegetali e animali
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