Reazioni cellulo-mediate in vitro e in vivo nella spigola (Dicentrarchus labrax)
Author(s)
Zarletti, Gianpaolo
Date Issued
March 16, 2010
Type
Doctoral Thesis
Abstract
Il lavoro sperimentale effettuato in questa tesi di dottorato è consistito nello studio
dell’attività di leucociti coinvolte in reazioni allogeniche, xeno geniche, di
immunomodulazione mediante pratiche di vaccinazione, studio dell’espressione genica e
produzione di un anticorpo anti CD8α. Nella prima fase sperimentale sono state studiate le
reazioni di leucociti di sangue periferico (PBL) “in vitro” in risposta a stimolo allogenico
derivante da PBL inattivati mediante irradiazione con raggi X nel teleosteo Dicentrarchus
labrax (spigola). I risultati ottenuti mostrano un marcato incremento del numero dei linfociti
T dopo 2 settimane di incubazione in reazioni unidirezionali di leucociti mescolati (MLR:
mixed leukocyte reaction). Viceversa i linfociti B non sembrano essere coinvolti nella MLR
in quanto i valori ottenuti sono paragonabili ai valori ottenuti dai PBL di controllo mantenuti
in coltura senza alcuno stimolo.
La proliferazione dei linfociti T è stata anche confermata mediante RT-PCR attraverso
l’analisi dell’espressione dell’ mRNA per il recettore dei linfociti T (TCR: T-cell receptor β).
Per contro è stato osservato un significativo decremento della proliferazione dei linfociti T
mediante l’aggiunta di 5 μg/ml di ciclosporina A (CsA) alle colture di MLR. I leucociti
prelevati dalle colture di MLR hanno mostrato un sensibile aumento dell’ attività citotossica
rispetto ai campioni di controllo, questo dato suggerisce la presenza ed il coinvolgimento di
linfociti citotossici (CTL) nelle reazioni di MLR. L’attivazione cellulare dei PBL in reazioni
di MLR a 2 settimane di incubazione è stata determinata mediante l’analisi della
mobilizzazione intracellulare di Ca2+ anticorpo-indotta misurata con Fura-2 AM. Con questa
metodica si è osservato un aumento della mobilizzazione di Ca2+ intracellulare negli MLR
mentre è diminuita con la presenza di CsA. Nella seconda fase sperimentale, invece, sono
state studiate reazioni di citotossicità verso bersagli xenogenici e l’immunomodulazione
derivante da vaccinazione. I risultati mostrano un coinvolgimento di linfociti T e B e per
quanto riguarda i pesci sottoposti a vaccinazione si evidenzia una notevole produzione di
immunoglobuline specifiche, ciò è stato anche evidenziato mediante lo studio dell’espressione
genica dei geni coinvolti in tali reazioni. Mediante esperimenti di Real-time PCR sono stati
studiati alcuni geni del sistema immunitario in vari organi emopoietici quali Timo, intestino
(GUT), rene cefalico (HK), milza (Spleen) e sangue periferico (PBL). La scelta di effettuare
indagini anche nell'intestino è maturata dal fatto che esso è il distratto anatomico in cui si
denota una predominante espressione di geni associati ai linfociti T. I risultati mostrano una
notevole presenza di geni correlati a cellule T nel timo e nell’intestino; ciò fa pensare che il
sistema immunitario acquisito possa aver avuto ed avere importanti correlazioni con il sistema
digerente. Dati preliminari ottenuti nel nostro laboratorio hanno dimostrato che che la
popolazione T del GALT contiene cellule CD8α+, TCRγ+ e ciò suggerisce una similarità con il
fenotipo cellulare IELs nei mammiferi.
Il lavoro effettuato durante la tesi rappresenta una determinazione diretta e quantitativa
di alcune attività delle cellule T e B “in vitro” in una specie di teleosteo. I dati ottenuti
chiariscono per la prima volta in un modello piscino alcune attività cellulari legate alle
risposte immunitarie e suggeriscono meccanismi conservati nell'evoluzione dei vertebrati.
Additional information
Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellulare
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