Understanding pathogenesis of Neisseria gonorrhoeae at three distinct human mucosal niches, studying bacterial/host interaction during bacterial adhesion and invasion
Author(s)
Zambelli, Marta
Date Issued
June 16, 2025
Type
Doctoral Thesis
Abstract
Neisseria gonorrhoeae (Ng) is the etiological agent of gonorrhea, a sexually transmitted infection (STI), which is a major global public health concern. Ng primarily acts as a mucosal colonizer, attaching to various epithelial surfaces through distinct structures such as the opacity proteins (Opa), which mediate adhesion to cervical epithelial cells via carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecules (CEACAM) receptors. A Luminex-based assay was developed to measure the interaction of diverse gonococcal strains with recombinant CEACAM 1, 3, 5 and 6. The ability of anti- Ng GMMA investigational vaccine serum to inhibit bacterial interaction or binding to the distinct CEACAM human ligands was also monitored. Furthermore, we characterized the adhesion of different Ng strains in 2D in vitro models, using immortalized cells representative of distinct sites including urethral, cervix, and oropharynx. Moreover, these cell lines were used to set up adhesion-inhibition assays with polyclonal and monoclonal antibodies. To further investigate the Opa-CEACAMs interactions during a time-course of infection in a complex tissue environment and under more physiologically relevant conditions, we used a 3D complex model of the human ectocervix tract. The binding of Ng to the CEACAMs was shown to be Opa-specific and different anti-GMMA sera differentially inhibited the interaction of a representative panel of strains with diverse CEACAM ligands, presumably depending on the alleles of Opa expressed by the diverse strains. Bacterial adhesion inhibition experiments showed that Ng GMMA sera is able to inhibit bacterial adhesion to Ect 1 E6/E7, End 1 E6/E7 and Detroit 562 cell lines. Moreover, we successfully infected the 3D model, as shown by confocal microscopy images and supported by CFU counts of tissue homogenates. The implementation of a 3D model allowed us to track the Ng infection for up to 48 hours. We observed a dose-dependent response of gonococcal infection on the models at 1- ,24- and 48- hours post-infection (hpi). Small groups of adherent bacteria were observed at 1 hpi, while large microcolonies and aggregates of Ng were evident at 24 hpi. Invasion of the epithelial cells was shown at 24 hours and progressed to 48-hours both intracellularly and extracellularly through junctions. Preliminary data suggest that bacterial adhesion inhibition could be achieved with mouse antisera- Ng GMMA on a 3D model infection. This study highlights the critical role of Ng-CEACAMs interaction in the female urogenital tract, demonstrating how 3D models allow for a more accurate characterization of Ng infection, providing a more detailed and complete Ng infection profile in association with CEACAM molecules, uncovering novel bacterial CEACAM interaction not identified in 2D cell line infections.
Neisseria gonorrhoeae (Ng) è l’agente responsabile della gonorrea, un’infezione sessualmente trasmissibile (IST) che rappresenta una seria minaccia per la salute pubblica a livello globale. Ng si comporta principalmente come colonizzatore delle mucose, aderendo a diverse superfici epiteliali attraverso strutture specifiche, tra cui le proteine di opacità (Opa), che mediano il legame con le cellule epiteliali cervicali tramite i recettori CEACAM (Carcinoembryonic Antigen-related Cell Adhesion Molecules).
Abbiamo sviluppato un saggio basato sulla tecnologia Luminex per analizzare l’interazione tra diversi ceppi gonococcici e i recettori CEACAM ricombinanti 1, 3, 5 e 6. Inoltre, abbiamo valutato la capacità di sieri ottenuti da un vaccino sperimentale a base di GMMA anti-Ng di inibire il legame batterico con questi recettori.
Abbiamo anche studiato l’adesione di diversi ceppi di Ng utilizzando modelli in vitro bidimensionali (2D) con linee cellulari immortalizzate rappresentative dei principali siti di infezione (uretra, cervice e orofaringe). Queste linee cellulari sono state impiegate anche per sviluppare saggi di inibizione dell’adesione mediante anticorpi policlonali e monoclonali.
Per approfondire il ruolo delle interazioni Opa–CEACAM durante le fasi dell’infezione, in un contesto tissutale complesso e più vicino alle condizioni fisiologiche, abbiamo utilizzato un modello tridimensionale (3D) dell’ectocervice umana. È emerso che il legame di Ng ai CEACAM è specificamente mediato dalle proteine Opa, e che la capacità dei sieri anti-GMMA di inibire questa interazione varia in funzione degli alleli Opa espressi dai diversi ceppi batterici.
I test di inibizione dell’adesione hanno dimostrato che i sieri anti-GMMA sono in grado di ridurre l’adesione di Ng alle linee cellulari Ect1 E6/E7, End1 E6/E7 e Detroit 562. Inoltre, siamo riusciti a infettare con successo il modello 3D, come confermato sia dalla microscopia confocale che dal conteggio delle unità formanti colonia (CFU) nei tessuti infettati. Questo modello ci ha permesso di monitorare l’infezione fino a 48 ore post-infezione (hpi), evidenziando una risposta dose-dipendente a 1, 24 e 48 ore. Già a 1 hpi erano visibili piccoli aggregati batterici adesi, che si sono evoluti in microcolonie più estese a 24 hpi. L’invasione delle cellule epiteliali è iniziata entro le 24 ore, progredendo fino alle 48 ore sia all’interno delle cellule sia attraverso le giunzioni cellulari.
I dati preliminari indicano che anche nel modello 3D è possibile ottenere un’inibizione significativa dell’adesione batterica utilizzando antisieri murini anti-GMMA. Questo studio sottolinea l’importanza delle interazioni tra Ng e CEACAM nel tratto urogenitale femminile e dimostra come i modelli tridimensionali offrano una rappresentazione più realistica e dettagliata dell’infezione gonococcica, permettendo di osservare meccanismi di interazione non rilevabili nei modelli 2D.
Additional information
Dottorato di ricerca in Scienze, Tecnologie e Biotecnologie per la Sostenibilità
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