Impact of chestnut ‘brown rot’ by Gnomoniopsis castaneae and mycotoxin producing fungi on fruit production and quality: mitigation measures in open field and post-harvest
Author(s)
Bastianelli, Giorgia
Date Issued
March 28, 2023
Type
Doctoral Thesis
Abstract
Chestnut (Castanea sativa, Miller) is a seasonal fruit found in many parts of the world, although most of commercial production is in Europe and Asia. Chestnut rot is a significant problem facing the chestnut industry (Sieber et al., 2007) and the highly perishable nature of the nut creates significant pre- and post-harvest challenges for industry. The predominant factors which reduce fresh-chestnut quality are microbiological internal decays, which are primarily related to mold, rot and insect damage (Moscetti et al., 2014). The main storage problems with chestnuts are the presence of insect worms (Cydia splendana Hb, C. fagliglandana Zel. and Curculio elephas Gyll.) and fungi development, mainly Cyboria, which clackens the flesh, but also Rhizopus, Fusarium, Collectotrichum and Phomopsis (Breisch, 1993; Washington et al., 1997). Since 2005, in Italy, France and Switzerland, chestnut growers have noticed an abnormal increase in the number of rotten nuts, locally affecting more than 80% of nuts (Maresi et al., 2013). Most of these nut rots were associated with an emerging fungal pathogen recently described as Gnomoniopsis castaneae, an ascomycete belonging to the family of Gnomoniaceae (Visentin et al., 2012). It is present most frequently in female flowers during the flowering period, the ascospores infect chestnut trees and particularly the flowers. The fungus then exists as a latent pathogen in reproductive and vegetative tissues, leading to the development of the disease during nut maturity (Shuttleworth & Guest, 2017). Furthemore, a broad number of organisms have been identified colonizing the product after harvest and causing chestnut decay. Among these, Penicillium sp., Aspergillus sp., Fusarium sp., Phomopsis castanea, Acrosperia mirabilis and Sclerotinia pseudotuberosa have been repeatedly identified. Improved mold control strategies are required for commercial chestnuts. Consequently, various pre-storage treatments have been adopted to reduce the likelihood of mold contamination, such as warm and cold baths (or “water curing”), which were developed in Italy during the 1930s. Thermo-hydrotherapy prior to cold storage, frequently paired with floating, is nowadays the standard method used for its proven ability to control insect infestations without influencing nut quality (Sieber et al., 2007). This treatment consists of placing nuts in steel cages and then pouring them in baths containing hot water at 50°C for 45 minutes and then pouring them in cold water to lower the temperature. The temperature for sterilization is the maximum that the nut protein can withstand without the risk of denaturing, while the duration of the treatment is determined according to the survival capacity of the insects. Furthermore, most of the control strategies are applied post-harvest, and little is known about the use of fungicides to reduce nut infection in orchards early in the season, beside the results obtained by Silva-Campos et al. (2022), using conventional fungicides. The research activities carried out during the PhD project aimed to solve the most problematic aspects of the chestnut industry, following the whole chestnut production chain, to find critical phases from the point of view of the healthiness of fruits.
For this reason, the first step was focused on pre-harvest, doing field treatments in a chestnut orchard in the Monti Cimini area to understand when and how brown rot can develop on chestnut trees. The focus was to block the disease spread during flowering season, using two different treatment’s methodologies (crown spray and endotherapy) and innovative products with the minimum impact on the environment (such as Phosphonate salts). Although a still ongoing debate on phosphonate salts use and efficacy in agriculture, they can be considered an optimal fungicide in chestnut orchards because of the low environmental impact when used at the recommended doses, the high translocability and stability, and the multiple mechanisms of actions. Phosphonate salts, and at first Zn-phosphonate, resulted highly effective to protect chestnut fruits from the “brown rot” fungus G. castaneae.
In addition, during post-harvest, chestnuts were sampled at different phases of the industrial storage process, to observe how brown rot can be reduced, for instance thanks to thermo-hydrotherapy. In a more detailed way, the present study demonstrated that application of strict conditions at the sterilization phase of chestnut handling can definitively inactivate G. castaneae in non-symptomatic and rotting fruits. Sterilization at 50 °C and over was not effective in inactivating the complex of fungal taxa responsible for contamination and development of moulds, many of which produce mycotoxins. The efficacy of the warm bath strictly depends on the quality of the fruit stocks entering the handling plant and the conditions to which they are exposed before the thermo-hydrotherapy. Always in each phase of chestnut handling, beside G. castaneae presence on fruits, also fungal population associated with chestnuts fruit, both in pulp and shell, was investigated; the methodology chosen was the Next-Generation Sequencing (NGS) technology and specifically metabarcoding based on Illumina de novo sequencing, able to identify the presence of a large number of distinct taxa in a single sample (Ruiz-Gomez et al, 2019). Simultaneously, mycotoxins’ contamination was evaluated through ELISA test for Aflatoxins, Ocratoxin A, Fumonisins and T-2/HT-2.
The positive results obtained, albeit preliminary, represent a promising step forward for harvest technologies employed in chestnut handling facilities. However, further studies are needed, both at laboratory and at the industrial plant level, to develop a better understanding of the critical points of fungal and toxin contamination in the chestnut treatment chain. In conclusion, the use of Phosphonate salts, highly effective against the “brown rot” fungus G. castaneae, in orchard management may complement the post-harvest processing of fruits by “heat treatments” in water that resulted efficient in completely inactivating G. castaneae in fruits. Indeed, the adoption of the appropriate management from the orchard to the processing plant will assure the minimal impact of the disease on fruit stocks for the market. In this sense, these studies, regarding pre-harvest and post-harvest, must be intended as synergic methodologies. An efficient strategy for the control of ‘brown rot’ must include mitigation protocols applied in the open field, followed by effective physical treatments in the handling plant. This combination of methods will ensure a safe and edible chestnut fruit, free from fungal and mycotoxin contaminations. This work will allow to extend the knowledge on the diversity of the fungal population that colonizes the chestnut fruit and at the same time, along the entire supply chain, to improve the conditions of treatment and conservation of the chestnut, in order to reduce the risk of contamination. The results obtained will be functional to application as target of control methods with low impact products to limit the population of fungi producer of mycotoxins.
La castagna (Castanea sativa, Miller) è un frutto stagionale diffuso in molte parti del mondo, anche se la maggior parte della produzione risiede in Europa e in Asia. Il marciume della castagna è un problema significativo per l'industria (Sieber et al., 2007) e la natura altamente deperibile dei frutti crea sfide significative prima e dopo la raccolta. I fattori predominanti che riducono la qualità della castagna fresca sono i deterioramenti interni, principalmente legati a muffe, marciumi e danni da insetti (Moscetti et al., 2014). I principali problemi di conservazione delle castagne sono la presenza di larve di insetti (Cydia splendana Hb, C. fagliglandana Zel. e Curculio elephas Gyll.) e lo sviluppo di funghi, principalmente Cyboria,, ma anche Rhizopus, Fusarium, Collectotrichum e Phomopsis (Breisch, 1993; Washington et al., 1997). Dal 2005, in Italia, Francia e Svizzera, i castanicoltori hanno notato un aumento anomalo del numero di frutti marci, interessando localmente oltre l'80% della frutta a guscio (Maresi et al., 2013). La maggior parte di questi marciumi del frutto era associata a un patogeno fungino recentemente descritto come Gnomoniopsis castaneae, un ascomicete appartenente alla famiglia delle Gnomoniaceae (Visentin et al., 2012). È presente più frequentemente nei fiori femminili durante il periodo della fioritura e le ascospore infettano i castagni e in particolare i fiori. Il fungo esiste quindi come patogeno latente nei tessuti riproduttivi e vegetativi, portando allo sviluppo della malattia durante la maturità del frutto (Shuttleworth & Guest, 2017). Inoltre, è stato identificato un ampio numero di organismi che colonizzano la castagna dopo la raccolta e provocano il marciume del frutto. Tra queste sono state più volte identificate Penicillium sp., Aspergillus sp., Fusarium sp., Phomopsis castanea, Acrosperia mirabilis e Sclerotinia pseudotuberosa. Per le castagne in commercio sono necessarie migliori strategie di controllo delle muffe. Di conseguenza, sono stati adottati vari trattamenti di pre-stoccaggio per ridurre la probabilità di contaminazione da muffe, come i trattementi in acqua calda o fredda (o curatura), sviluppati in Italia negli anni '30. La termo-idroterapia prima della conservazione in cella fredda, spesso abbinata alla flottazione, è oggi il metodo standard utilizzato per la sua comprovata capacità di controllare le infestazioni di insetti senza influenzare la qualità della frutta a guscio (Sieber et al., 2007). Questo trattamento consiste nel porre i frutti in vasche di acciaio contenenti acqua calda a 50°C per 45 minuti e successivamente trasferirle in acqua fredda per abbassarne rapidamente la temperatura. La temperatura di sterilizzazione è la massima che le proteine del frutto può sopportare senza il rischio di denaturazione, mentre la durata del trattamento è determinata in base alla capacità di sopravvivenza degli insetti. Inoltre, la maggior parte delle strategie di controllo sono applicate post-raccolta e poco si sa sull'uso di fungicidi per ridurre l'infezione dei frutti nei castagneti all'inizio della stagione, a parte i risultati ottenuti da Silva-Campos et al. (2022), utilizzando fungicidi convenzionali. Le attività di ricerca svolte durante il progetto di dottorato hanno avuto l'obiettivo di risolvere gli aspetti più problematici della filiera castanicola, seguendo l'intera filiera produttiva della castagna, per individuare le fasi critiche dal punto di vista della salubrità dei frutti.
Per questo il primo scopo è stato incentrato sulla fase pre-raccolta, effettuando trattamenti in campo in un castagneto dei Monti Cimini al fine di comprendere quando e come si può sviluppare il marciume bruno nei castagneti. L'obiettivo era bloccare la diffusione della malattia durante la stagione della fioritura, utilizzando due diverse metodologie di trattamento (trattamento fogliare ed endoterapia) e prodotti innovativi con il minimo impatto sull'ambiente (come i sali fosfonati). Nonostante sia ancora in corso un dibattito sull'utilizzo e l'efficacia dei sali fosfonati in agricoltura, questi possono essere considerati ottimi fungicidi nei castagneti garzie al loro basso impatto ambientale se utilizzati alle dosi consigliate, all'elevata traslocabilità e stabilità e ai loro molteplici meccanismi di azione. I sali fosfonati, soprattutto il fosfonato di Zn, sono risultati molto efficaci per proteggere le castagne da G. castaneae, fungo responsabile del “marciume bruno”.
Inoltre, durante il periodo post-raccolta, le castagne sono state campionate in diverse fasi del processo di stoccaggio industriale, per comprendere come ridurre il marciume bruno, ad esempio grazie alla termo-idroterapia. In modo più dettagliato, il presente studio ha dimostrato che l'applicazione di condizioni stringenti nella fase di sterilizzazione delle castagne può inattivare definitivamente G. castaneae in frutti non sintomatici e in decomposizione. La sterilizzazione a 50 °C e oltre non è risultata efficace nell'inattivare il complesso di taxa fungini responsabili della contaminazione e dello sviluppo di muffe, molte delle quali producono micotossine. L'efficacia della termo-idroterapia dipende strettamente dalla qualità dei frutti che entrano nell'impianto industriale e dalle condizioni a cui sono esposti prima della termo-idroterapia. Sempre in ogni fase industriale post-raccolta, oltre alla presenza di G. castaneae sui frutti, è stata indagata anche la popolazione fungina associata alle castagne, sia nella polpa che sul guscio; la metodologia scelta è stata la tecnologia Next-Generation Sequencing (NGS) e nello specifico il metabarcoding basato sul sequenziamento Illumina de novo, in grado di identificare la presenza di un gran numero di taxa fungini in un singolo campione (Ruiz-Gomez et al., 2019). Contemporaneamente è stata valutata la contaminazione da micotossine mediante test ELISA per Aflatossine, Ocratossina A, Fumonisine e T-2/HT-2.
I positivi risultati ottenuti, seppur preliminari, rappresentano un promettente passo avanti per le tecnologie di post-raccolta delle castagne impiegate negli impianti industriali. Sono tuttavia necessari ulteriori studi, sia a livello di laboratorio che a livello di impianto industriale, per arrivare ad una migliore comprensione dei punti critici per la contaminazione da funghi e micotossine nella filiera della castagna. In conclusione, l'utilizzo nei castagneti di sali fosfonati, altamente efficaci contro l’agente causale del “marciume bruno”, può integrare la lavorazione post-raccolta dei frutti mediante trattamenti termici efficaci nell'inattivare completamente G. castaneae. In effetti, l'adozione di una gestione appropriata dal frutteto all'impianto di trasformazione può assicurare un impatto minimo della malattia sulle castagne destinate al mercato. Seguendo tale criterio, questi studi effettuati in pre-raccolta e post-raccolta devono essere intesi come metodologie sinergiche. Una strategia efficiente per il controllo del "marciume bruno" deve includere protocolli di mitigazione applicati in pieno campo, seguiti da trattamenti fisici efficaci nell'impianto industriale. Questa combinazione di metodi garantirà un frutto sano e privo di contaminazioni da funghi e micotossine. Il presente lavoro consentirà di ampliare le conoscenze sulla diversità della popolazione fungina che colonizza la castagna e allo stesso tempo, lungo tutta la filiera, di migliorare le condizioni di trattamento e conservazione del frutto, al fine di ridurre il rischio di contaminazione. I risultati ottenuti saranno funzionali all'applicazione di metodi di controllo con prodotti a basso impatto per limitare la popolazione di funghi produttori di micotossine.
Additional information
Dottorato di ricerca in Scienze, tecnologie e biotecnologie per la sostenibilità
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