The eIF3d-RACK1 specialized protein translation in learning and memory formation in Drosophila melanogaster
Author(s)
Silvestri, Federica
Date Issued
July 14, 2023
Type
Doctoral Thesis
Abstract
Canonical protein synthesis plays an important role in synaptic plasticity, learning, and memory formation. The two main targets of the canonical initiation regulation are eIF4E, whose binding to the eIF4G protein is critical for initiation translation and controlled by many regulator proteins, and eIF2α, whose phosphorylation is crucial in amygdala-based memory. Dysfunction of eIF4E or eIF2α leads to impairment in learning and learning-related synaptic plasticity. Considering the existence of alternative protein translation mechanisms, the canonical protein synthesis might not be the only one involved in learning and memory processes. Here, we show that the eIF3d-RACK1 specialized translation plays a fundamental role in Drosophila melanogaster Mushroom Bodies development and in learning and memory formation. In fact, the downregulation of eIF3d and the overexpression of RACK1 cause defects in the MBs structure and, consequently, in learning abilities. This could be due to the increase in protein synthesis rate and in variations in Dlg1 expression. We have demonstrated also that double transgenic flies for eIF3d and RACK1 show a recovery in MBs structure, learning, and at the molecular level. Thus, these results provide a new control mechanism in learning and memory formation, which could be pivotal in pathologies with impaired cognitive and mnemonic abilities.
La sintesi proteica canonica svolge un ruolo importante nella plasticità sinaptica, nell'apprendimento e nella formazione della memoria.
I due fattori principali coinvolti nella regolazione dell'inizio di sintesi proteica canonica sono eIF4E, il cui legame con la proteina eIF4G è fondamentale per l’inizio di traduzione e controllato, a sua volta, da molte proteine regolatrici, e eIF2α, la cui fosforilazione è cruciale nella memoria basata sull'amigdala.
Alterazioni nell’espressione di eIF4E o eIF2α compromettono l’apprendimento e la plasticità sinaptica correlata all'apprendimento.
Dal momento che esistono dei meccanismi alternativi di traduzione proteica, la sintesi proteica canonica potrebbe non essere l'unica coinvolta nei processi di apprendimento e memoria.
Pertanto, lo scopo di questo lavoro di tesi è quello di investigare il ruolo della traduzione specializzata eIF3d-RACK1 nell'apprendimento e nella formazione della memoria. A tale scopo, sono stati utilizzati i Mushroom Bodies (MBs) della Drosophila melanogaster, che sono le strutture nervose deputate alla ricezione olfattiva, all'apprendimento e alla memoria. Proprio per la funzione che svolgono nella memoria, i MBs sono paragonabili all'ippocampo umano.
eIF3d è uno dei fattori coinvolti nella traduzione eIF4F-indipendente. Infatti, attraverso la sua capacità di legare il cappuccio di 7-metilguanosina al 5'UTR dell’mRNA, consente l'inizio della traduzione senza la formazione del complesso eIF4F (Lee et al., 2016). Inoltre, è stato dimostrato che eIF3d interagisce con RACK1, che svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo neuronale, regolando la crescita degli assoni e partecipando alla traduzione locale dendritica di specifici mRNA per promuovere lo sviluppo neuronale. Inoltre, RACK1 recluta eIF3d sul ribosoma, consentendo la traduzione di specifici mRNA.
Per prima cosa, l'espressione di eIF3d e RACK1 è stata modulata nei MBs. I MBs sono costituiti da circa 2500 Kenyon cells (KCs). In ciascun emisfero, i dendriti dei Mushroom Bodies costituiscono il calice, mentre gli assoni formano il peduncolo e i lobi. I lobi si dividono in lobi verticali (α, α’) e orizzontali (β, β’ e γ), formando la tipica struttura anatomica lobulare MBs.
I dati ottenuti hanno rivelato che la riduzione dell’espressione di eIF3d causa forti difetti nella struttura dei MBs. Infatti, le Kenyon cells sono ridotte di circa il 50% e i lobi α’/α e β’/β risultano più sottili, più disorganizzati e allungati rispetto a quelli osservati nelle drosophile di controllo. Questi difetti strutturali causano anche difetti nelle capacità di apprendimento e nel comportamento.
Le drosophile che sovraesprimono RACK1, invece, mostrano alterazioni strutturali dei MBs e difetti nel comportamento, simili a quelli osservati nelle drosophile in cui l’espressione di eIF3d è ridotta. Inoltre, è stato osservato un ritardo dello sviluppo larvale di circa 24-48 ore sia per le larve che downregolano eIF3d che per le larve che sovraesprimono RACK1.
Lo stesso fenotipo, con un ritardo nello sviluppo larvale e forti difetti nella struttura dei MBs, che riflettono importanti difetti nelle capacità di apprendimento e nel comportamento, sono stati osservati anche nelle drosophile in cui l’espressione di eIF4E è ridotta.
Tuttavia, le drosophile doppie transgeniche per eIF3d e RACK1 mostrano un recupero nella struttura dei MBs e di conseguenza nell'apprendimento e nel comportamento. Inoltre, le larve non presentano ritardo nel loro sviluppo e raggiungono lo stadio pupale in 3-4 giorni.
Per investigare le ragioni di questo recupero, sono state effettuate alcune indagini molecolari. Innanzitutto, è stata studiata la sintesi proteica, considerando il ruolo di eIF3d e RACK1 nella traduzione eIF4F-indipendente.
Le drosophile che downregolano eIF3d e che sovraesprimono RACK1, rispettivamente, hanno mostrato un aumento del tasso di sintesi proteica, che viene riportato a livelli wild-type nei doppi transgenici per queste proteine.
Successivamente, sono stati analizzati i livelli di espressione di p-eIF2α, altro target fondamentale nel controllo traduzionale. Inoltre, p-eIF2α svolge un ruolo fondamentale nella plasticità sinaptica e nella formazione della memoria.
I risultati ottenuti hanno rivelato che negli animali singoli transgenici e nelle drosophile doppie transgeniche per eIF3d e RACK1, l'espressione di p-eIF2α rimane invariata rispetto agli animali di controllo.
Inoltre, i dati acquisiti sui singoli neuroni hanno mostrato che la downregolazione di eIF3d e la sovraespressione di RACK1 causano una riduzione delle dimensioni dei neuroni e un minor numero di arborizzazioni.
Inoltre, è noto che nei neuroni RACK1 interagisce con la proteina legante l'RNA Fragile X Mental Retardation protein (FMRP). La ridotta espressione di FMRP determina uno sviluppo dendritico e assonale aberrante, che sono considerate due caratteristiche importanti dei pazienti con sindrome dell'X fragile. Il legame di FMRP con RACK1 rimuove l'attività repressiva traslazionale di FMRP e promuove la traduzione dell'mRNA della densità post-sinaptica (PSD-95).
Considerando questi dati, è stata studiata l'espressione di Dlg1, l'ortologo di PSD-95.
I risultati hanno rivelato che la sovraespressione di RACK1 determina un aumento dell'espressione di Dlg1, mentre la sottoregolazione di eIF3d ha determinato una riduzione dell'espressione di Dlg1. Dal momento che Dlg1 svolge un ruolo importante nella plasticità sinaptica, le alterazioni nell'espressione di Dlg, determinate sia dalla sovraespressione di RACK1 che dalla downregolazione di eIF3d rispettivamente, potrebbero determinare i difetti osservati nella struttura dei MBs e, conseguentemente, nell’apprendimento e nel comportamento. Infatti, nelle drosophile doppie transgeniche, in cui l'espressione di Dlg1 è riportata a livelli wild-type, anche le alterazioni nelle strutture dei MBs sono recuperate e gli animali mostrano un comportamento normale e normali capacità di apprendimento.
In conclusione, i risultati ottenuti in questo lavoro di dottorato suggeriscono che la traduzione specializzata eIF3d-RACK1 potrebbe svolgere un ruolo fondamentale nell'apprendimento e nel comportamento, come dimostrato dai fenotipi ottenuti modulando l'espressione di queste due proteine. Dai dati ottenuti, inoltre, sembra che l'asse traduzionale eIF3d-RACK1 abbia un ruolo nell'apprendimento e nella formazione della memoria paragonabile a quello svolto dalla traduzione dipendente da eIF4E.
La traduzione specializzata eIF3d-RACK1 agisce sullo sviluppo dei MBs e di sull'apprendimento e sulla formazione della memoria modulando i livelli di sintesi proteica e l'espressione di Dlg1.
Additional information
Dottorato di ricerca in Scienze, tecnologie e biotecnologie per la sostenibilità
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