Functional Analysis of Genomic Variants Involved in Neurodevelopmental and Neurodegeneration Disorders in Zebrafish in vivo Models
Author(s)
Paradisi, Graziamaria
Date Issued
July 4, 2024
Type
Doctoral Thesis
Abstract
Tubulinopathies are a clinically variable group of chronic, early-onset degenerative rare conditions, affecting nervous system development, severely affecting patients and their families. Thanks to Next Generation Sequencing (NGS) and functional validations of candidate variants, we know that mutations in genes encoding tubulins and their interacting proteins and chaperons likely linked to altered microtubules dynamics are causative of these conditions. However, a lack of knowledge of the mechanisms underlying the pathogenic event limit diagnosis and treatments. As part of a multidisciplinary program dedicated to patients without diagnosis my PhD research at Ospedale Pediatrico Bambino Gesù contributed to the characterization of zebrafish models of two tubulinopathies with progressive neurodegeneration and motor dysfunction. My work focused on modelling in zebrafish the effect of loss of function (LoF) mutations in the tubulin chaperons TBCD and TBCE, necessary for the assembly/disassembly of cytoskeletal microtubules. Despite previous experimental evidence obtained from patients' cells has shown impaired microtubule polymerization (increased for TBCD and decreased for TBCE LoF) in vitro, the mechanism by which aberrant chaperones and hyper-stable or unstable MTs impact nervous system physiological processes in a developing organism is still not clear. In order to determine the impact of TBCD and TBCE LoF on motor neuron formation, in my PhD work I used the small fish zebrafish as in vivo vertebrate disease model, which is transparent, easy to handle and shows high conservation of genes and proteins with humans. My work initially demonstrated the conservation analysis of TBCD and TBCE amino-acids sequence between human and zebrafish. Using cDNA produced by RNA collected from zebrafish embryos at different stages the experiment showed tbcd and tbce expression during critical developmental windows for nervous system formation. Then, given the clinical features of the patients, I employed transient zebrafish tbcd and tbce LoF models generated in the lab by morpholino-based approach and assessed key developmental windows for motor system formation. My experimental activity focused on the morphological characterization of neuronal defects in both models using optimized immunofluorescence and high-resolution confocal microscopy protocols and 3D image analysis. The data show a variable impact of tbcd and tbce LoF, and a clear impairment of motoneurons development in both models with axon truncation and pathfinding errors, as well as a stronger effect for tbce LoF. Reduced innervation for tbcd were also confirmed in stable crispant G0 models (CRISPR-Cas9 genome editing approach), which also highlighted muscle deterioration. During the last part of my PhD, I had the opportunity to attempt a preliminary investigation on the possible molecular mechanism underlying spinal motor neurons defects in the stable tbcd G0 crispant model at early stage of development assessing microtubules within extending neurites. The data demonstrate and important function of TBCD and TBCE during motoneurons development and offer a basis for future functional analyses.
Le tubulinopatie sono un gruppo clinicamente variabile di condizioni croniche e degenerative rare ad esordio precoce riguardanti lo sviluppo del sistema nervoso e che colpiscono gravemente i pazienti e le loro famiglie. Grazie al Sequenziamento di Nuova Generazione (NGS) e alla validazione funzionale delle varianti candidate, sappiamo che mutazioni nei geni codificanti per le tubuline e i loro chaperoni e interattori proteici, probabilmente collegati ad un’alterata dinamica dei microtubuli, sono causative di queste condizioni. Tuttavia, la mancata conoscenza dei meccanismi che sottendono all’evento patologico limita la diagnosi e trattamento. Nell’ambito di un programma multidisciplinare dedicato ai pazienti orfani di diagnosi, il mio lavoro di dottorato presso l’Ospedale Pediatrico Bambino Gesù ha contribuito alla caratterizzazione di modelli zebrafish per due tubulinopatie caratterizzate da una progressiva neurodegenerazione e disfunzione motoria. Il mio lavoro è incentrato sulla modellazione in zebrafish dell’effetto delle mutazioni con perdita di funzione (LoF) degli chaperoni della tubulina TBCD e TBCE, necessari per l'assemblaggio/disassemblaggio dei microtubuli citoscheletrici. Nonostante precedenti evidenze sperimentali ottenute da cellule di pazienti hanno mostrato una ridotta polimerizzazione dei microtubuli in vitro (aumentata per TBCD e ridotta per TBCE LoF), il meccanismo attraverso il quale chaperoni aberranti e MT iperstabili o instabili influenzano i processi fisiologici del sistema nervoso in un organismo in via di sviluppo non è ancora chiaro. Al fine di determinare l'impatto delle LoF di TBCD e TBCE sulla formazione dei motoneuroni, nel mio lavoro di dottorato ho utilizzato lo zebrafish come modello vertebrato di malattia in vivo, che è trasparente, facile da gestire e mostra un'elevata conservazione di geni e proteine con gli esseri umani. Inizialmente il mio lavoro ha dimostrato l'analisi di conservazione della sequenza di aminoacidi TBCD e TBCE tra uomo e zebrafish. Utilizzando il cDNA prodotto dall'RNA raccolto da embrioni di zebrafish a diverso stadio di sviluppo, l'esperimento ha evidenziato l'espressione di tbcd e tbce durante le finestre di sviluppo critiche per la formazione del sistema nervoso. Successivamente, date le caratteristiche cliniche dei pazienti, ho utilizzato modelli LoF tbcd e tbce transienti di zebrafish, generati in laboratorio mediante approccio basato sul morfolino, e ho valutato le finestre di sviluppo chiave per la formazione del sistema motorio. La mia attività sperimentale si è incentrata poi sulla caratterizzazione morfologica dei difetti neuronali in entrambi i modelli utilizzando protocolli di immunofluorescenza ottimizzati e microscopia confocale ad alta risoluzione e analisi di immagini 3D. I dati mostrano un impatto variabile delle LoF di tbcd e tbce ed una chiara compromissione dello sviluppo dei motoneuroni in entrambi i modelli con errori di troncamento degli assoni e di pathfinding, nonché un effetto più forte per la LoF di tbce. La ridotta innervazione nel modello transiente tbcd è stata confermata anche nei modelli G0 crispanti stabili (approccio di editing genomico CRISPR-Cas9), che hanno evidenziato anche un deterioramento muscolare. Durante l'ultima parte del mio dottorato, ho avuto l'opportunità di condurre un'indagine preliminare sul possibile meccanismo molecolare alla base dei difetti dei motoneuroni spinali nel modello crispante G0 tbcd stabile a stadio precoce di sviluppo, valutando i microtubuli all'interno di neuriti in estensione. I dati dimostrano l'importante funzione di TBCD e TBCE durante lo sviluppo dei motoneuroni e offrono una base per future analisi funzionali.
Additional information
Dottorato di ricerca in Scienze, Tecnologie e Biotecnologie per la Sostenibilità
File(s)![Thumbnail Image]()
Name
gparadisi_tesid.pdf
Size
4.29 MB
Format
Adobe PDF
Checksum (MD5)
7c7482a0c5b83998cd485acb9e3fb985