Identificazione e validazione della proteina CSB come oncogene
Author(s)
Caputo, Manuela
Date Issued
May 5, 2015
Type
Doctoral Thesis
Abstract
La proteina Cockayne Syndrome group B (CSB) è
una ATPasi, appartenente alla famiglia
SWI2/SNF, che lega il DNA e rimodella la cromatina. Mutazioni nel gene csb danno origine
alla Sindrome di Cockayne (CS), una malattia autosomica recessiva caratterizzata da
invecchiamento precoce che ha effetti sulla crescita, lo sviluppo ed il mantenimento di una
vasta gamma di tessuti ed organi. Nel contesto del metabolismo cellulare, CSB svolge
molteplici funzioni: la proteina partecipa al meccanismo di riparazione del DNA associato
alla trascrizione (TCR), gioca un ruolo durante la trascrizione del DNA e regola
negativamente l’attività
dell’oncosoppressore p53.
In questo lavoro abbiamo dimostrato che differenti tessuti e linee cellulari tumorali
mostrano un notevole aumento dell’espressione della proteina CSB. Inoltre, abbiamo
provato che la down-regolazione transiente di questa proteina, mediante l’utilizzo di
oligonucleotidi antisenso, causa effetti devastanti nelle cellule tumorali, che la
sovraesprimono; in particolare, abbiamo osservato una drastica riduzione dei livelli di
proliferazione e di vitalità cellulare, oltre che una induzione di morte per apoptosi.
Inoltre, abbiamo dimostrato che la down-regolazione di questa proteina non ha alcun effetto
sulla proliferazione, vitalità
ed induzione dell’apoptosi nelle cellule sane.
In aggiunta, la down-regolazione di CSB rende le cellule tumorali più
sensibili ad una
varietà
di farmaci chemioterapici di tipo tradizionale, quali Oxaliplatino, Mitomicina-C e 5-
Fluorouracile. Infatti, dopo il trattamento combinato (oligonucleotidi antisenso per silenziare
CSB + farmaco chemioterapico), le cellule tumorali mostrano un maggior effetto di
riduzione della vitalità
cellulare ed induzione del processo apoptotico rispetto alle cellule
tratatte con il solo chemioterapico, con il vantaggio di poter ridurre la dose di
chemioterapico somministrato e quindi la tossicità ad esso associata.
Alla luce di questi dati abbiamo supposto che CSB possa funzionare come un vero e proprio
oncogene all’interno delle cellule neoplastiche che sono spinte ad up-regolarla per la loro
sopravvivenza.
Riteniamo, perciò, che CSB rappresenti un target strategico per lo sviluppo di nuove terapie
antitumorali note con il nome di
targeted therapy. Si tratta di terapie che prevedono
l’utilizzo di farmaci definiti “intelligenti” la cui caratteristica fondamentale è
la loro
straordinaria selettività
d’azione in quanto agiscono in maniera selettiva solo su proteine
sovraespresse o specifiche delle cellule tumorali.
Nella seconda parte di questa tesi di dottorato abbiamo svolto degli esperimenti per
comprendere il ruolo che CSB svolge nel promuovere il fenotipo tumorale e il meccanismo
che sottostà
all’induzione del processo apoptotico in seguito al suo silenziamento; nello
specifico abbiamo cercato di comprendere in quali pathaway CSB esplica la sua funzione
oncogenica e quali meccanismi molecolari sono attivati o repressi in seguito al suo
silenziamento. Per fare questo ci siamo avvalsi della tecnologia dei microarray.
Questa analisi ha evidenziato la presenza di una modificazione del profilo trascrizionale
indotto dal silenziamento di CSB in cellule HeLa. Nello specifico abbiamo scoperto che la
riduzione di CSB, in queste cellule, determina sia una sovraespressione
di geni che sono
indotti in seguito alla presenza di stress del Reticolo Endoplasmatico (ER stress) e di diversi
geni apoptotici, sia la down-regolazione di geni tra i quali quelli codificanti per vari
chaperoni molecolari. Questo scenario suggerisce che nelle cellule HeLa silenziate per CSB,
un persistente ER stress, induce il processo apoptotico anziché
una risposta adattativa.
Abbiamo, infine, creato una linea cellulare silenziata in maniera stabile per CSB (HeLa
shCSB) per effettuare degli studi mediante l’utilizzo di molecole in grado di indurre l’ER
stress; questo al fine di valutare se l’assenza di CSB rendesse le cellule HeLa più
sensibili al
trattamento con tali sostanze.
Tutti questi studi sono volti a capire quale sia effettivamente il ruolo che CSB svolge
all’interno delle cellule tumorali, ponendo l’attenzione sull’azione protettiva che questa
proteina ha sulla loro vitalità e sopravvivenza.
In the present study we show that a number of cancer cell lines from different tissues
display dramatically increased expression of the Cockayne Syndrome group B (CSB)
protein, a DNA repair factor, that has recently been shown to be involved in cell
robustness. CSB is a SWI/SNF-like DNA-dependent ATPase that can wind DNA and
remodel chromatin. Mutations in the csb gene give rise to Cockayne syndrome (CS), an
autosomal recessive disorder characterized by premature aging and affecting growth,
development and maintenance of a wide range of tissues and organs. In the context of cell
metabolism, CSB plays a number of different functions. This protein participates in the
transcription coupled repair (TCR) sub-pathway of nucleotide excision repair (NER).
TCR rapidly removes bulky DNA lesions located on the transcribed strand of active
genes. In addition, CSB plays a role during transcription by stimulating all three classes
of nuclear RNA polymerases. Finally, CSB plays a critical role in cell robustness by
negatively modulating p53 activity after cellular stress, including DNA damage and
hypoxia. CSB performs two main functions by counteracting p53 activity: first, by
interacting with p53, CSB releases and redistributes the limiting transcriptional co-factor
p300 acetyl-transferase to gene expression programs with opposite purposes (pro-survival
pathways); second, CSB down-regulates the cellular levels of p53, by stimulating its
ubiquitination and degradation. Accordingly, the deregulation of p53 and the subsequent
enhanced apoptotic response in the absence of the CSB protein gives rise to the
pronounced cell fragility observed in CS patients upon exposure to stressors of a broad
nature. Moreover, it is known that CSB also counteracts p53-independent apoptosis.
Therefore, it seems that CSB functions as an anti-apoptotic factor that re-equilibrates the
physiological response toward cell proliferation and survival rather than cell cycle arrest
and cell death upon stress. Based on these findings, we believe that CSB represents a
strategic target for anticancer therapy. Our hypothesis suggests that the inhibition or
down regulation of CSB in cancer cells may result in the down regulation of pro-survival
programs aimed to allow cancer cells to evade apoptosis. In fact, in the present study we
showed that CSB is overexpressed in a variety of cancer cell lines and tissues.
Importantly, the down regulation of CSB in these cancer cells resulted in a marked
increase of apoptosis. Furthermore, down regulation of CSB also made these cells
hypersensitive to anti-cancer chemotherapeutic drugs. Moreover, we demonstrated that
ablation of this protein by antisense technology causes devastating effects on tumor cells
through a drastic reduction of cell proliferation and massive induction of apoptosis, while
non-transformed cells remain unaffected. Finally, suppression of CSB in cancer cells
makes these cells hypersensitive to a variety of commonly used cancer chemotherapeutic
agents. Based on these results, we conclude that cancer cells overexpress CSB protein in
order to enhance their anti-apoptotic capacity. The fact that CSB suppression specifically
affects only cancerous cells, without harming healthy cells, suggests that CSB may be a
very attractive target for the development of new anticancer therapies.
In the second part of our work, we wanted to better understand genome-wide expression
changes associated with the suppression of CSB expression in HeLa cells, and we utilized
the DNA microarray analysis. Total RNA from three different controls (untreated,
transfectant reagent treated and transfectant reagent + sense DNA treated) and CSB
suppressed cells (transfectant reagent + antisense DNA treated) was prepared 6 and 12 h
after transfection and subjected to microarray hybridization using Agilent SurePrint G3
8x60K arrays. We selected 69 genes whose expression was up-regulated, whereas 144
genes were down-regulated by CSB suppression. We found that many up regulated genes
in CSB silenced cells are induced by ATF4, a fundamental transcription factor and an
important mediator of the UPR, and are downstream of ATF4 in the UPR induction
cascade. In response to ER stress, eIF2a phosphorylation by PERK induces ATF4
expression, which is required for increased expression of ATF3 and other genes including
GADD45a and NOXA. ATF3 is required for increased levels of apoptotic genes such as
GADD34, CHAC1 and CHOP. Accordingly, our analysis showed up regulation of all
these genes. The mediated ER stress-induced cell death transcription factor CHOP (also
known as growth-arrest and DNA-damage-inducible gene 153), which is strongly
induced in response to ER stress, display a significant 6,73 fold increase of its expression
compared to untreated control cells. CHOP activates the transcription of several genes
that may potentiate apoptosis. These include Gadd34, Trib3 (Tribbles homolog 3) and
PUMA (BBC3), genes that we found up regulated in CSB silenced cells (4,63, 3,86 and
3,78 fold increase, respectively). Our preliminary microarray data shows that CSBsuppressed
cells display up-regulation of different apoptotic genes involved in UPR
response, such as PUMA, NOXA and TRIB3. This scenario suggests that in CSBsuppressed
HeLa cells, a persistent ER stress, induces the apoptosis rather an adaptive
response. In conclusion, further studies might be envisaged to understand why different
tumor cell lines overexpress CSB and why its down-regulation induces ER stess in these
cell.
Additional information
Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellulare
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