Secondary metabolites from filamentous fungi: potential of a novel Aspergillus species
Author(s)
Felli, Martina
Date Issued
November 30, 2021
Type
Doctoral Thesis
Abstract
Global resistance to drugs for existing diseases and new infections that have been reported in recent times pushes towards need to find new natural bioactive compounds. Secondary metabolites (SMs), low-molecular-mass organic compounds not directly involved in growth, development or reproduction of the producing organism, can be investigated for this intent. Among SMs many natural fungal products have biotechnological potential such as antibiotics, antifungal or anticancer agents representing a major source of approved drugs and still play an important role in supplying chemical diversity. Fungi isolated from extreme environments are an excellent potential source of natural products with novel and/or unusual chemical structures. Life in a stressful habitat, such as high salinity, high radiation, extreme temperatures and pressures and variable acidity, pushes towards the production of compounds useful for survival and adaptation to unfavorable living conditions. Fungal biosynthetic capacity of SMs resides into sections of microbial genome named “biosynthetic gene clusters” (BGCs) consist of repeating units or modules typically controlling the incorporation of one molecular entity into the final structure. Often, many BGCs are silent under standard cultivation conditions so they can be induced with the use of different approaches to stimulate their expression with the consequent production of bioactive molecules.
In this contest, this PhD thesis was aimed at researching secondary bioactive compounds from microbial sources to find possible used in the pharmaceutical field. Microbial source have the advantage of feasible and sustainable production of large quantities of anti-infective natural products by large-scale cultivation at reasonable costs.
In particular, the first aim was to use osmotic stress in halotolerant fungal species in order to induce the production of new bioactive compounds that are not expressed in standard growth conditions. It is already known that the presence of sodium chloride has the potential to influence the production of known compounds or the synthesis of new biologically active secondary metabolites not yet known. So, in this PhD thesis project facultative marine derived fungi are used for discovery and exploitation of new bioactive molecules, due to the adaptation to stressful growth conditions and the development of specific biosynthetic pathways.
Furthermore, the study of SMs produced by a novel microbial species increases chances to identify biologically active natural compounds not yet known to be used in pharmaceuticals industry. So, another important aim was the investigation of a new species of Aspergillus in order to know the biosynthetic potential of secondary bioactive metabolites and to research new compounds to be applied in the biotechnological/pharmaceutical field.
Besides CHAPTER 1, where a general state of the art on fungal secondary metabolites has been described, in CHAPTERS 2-5 experimental procedures and designes have bee reported.
In CHAPTER 2 filamentous fungi are investigated for biological activity of secondary metabolites under different conditions of osmotic stress. For the discovery of secondary molecules, OSMAC (One-Strain-Many-Compounds) approach was employed, using different cultivation conditions using sodium chloride to regulate the transcription of genes linked to different secondary metabolites. The results showed that fungal species belonging to the genera Penicillium, Aspergillus, Alternaria, Trichoderma and Arthrinium were able to produce extracts characterized by biological activity. Aspergillus 6C2, furtherly identified as as new specie A. olivimuriae, stand out
for its bioactivity, showing antimicrobial activity against gram + bacteria, strong antioxidants and anti Quorum Sensing capabilities.
CHAPTER 3 deals with the morphological and molecular characterization for the taxonomic location of the new species of Aspergillus. Aspergillus strain NRRL 66783 stood out for its bioactivity, isolated from the olive brine, was identified and characterized at the macroscopic and microscopic morphological level and at the molecular level. It has been identified with molecular methods sequencing the identification markers rDNA internal transcribed spacer region (ITS1-5.8S-ITS2), calmodulin (CaM), β-tubulin (BenA) and second largest subunit of RNA polymerase II (RPB2). Based on the source of isolation, the new species has been named Aspergillus olivimuriae and it was located as the most basal species in sect. Flavipedes. It was found tolerant to high concentrations of NaCl (15 %) or sucrose (60 %) and it exhibits substantial growth under these conditions. Although the new species grew profusely at 37 °C, no growth was observed at 40 °C, conidia en masse were avellaneous on all media. The whole genome has been sequenced.
Final step of this PhD thesis project has been treated in CHAPTER 4 and concerns the study of Aspergillus olivimuriae sp. nov. secondary metabolome. The study was conducted both on a genomic scale and through the OSMAC approach. In order to predict the productive potential of secondary metabolites, a bioinformatic study of biosynthetic gene clusters was carried out using two prediction programs, AntiSMASH and SMURF; analysis revealed the presence of biosynthetic gene clusters of secondary metabolites known to be associated with toxins, antitumor compounds and antimicrobials. Parallel to bioinformatics study Aspergillus olivimuriae was preliminarily investigated for the productive capacities of secondary metabolites. Through the use of HPLC-DAD analysis the inductive effect for the production of exometabolites due to the addition of salt, enzyme inhibitors and sucrose was studied. It has been observed that the growth of the fungus on salt is the condition that most modifies the metabolic profile of A. olivimuriae, clearly decreasing the production of compounds.
La resistenza globale ai farmaci per le malattie esistenti e le nuove infezioni segnalate negli ultimi tempi spinge verso la necessità di trovare nuovi composti bioattivi naturali. A questo scopo possono essere studiati metaboliti secondari (SM), composti organici a bassa massa molecolare non direttamente coinvolti nella crescita, nello sviluppo o nella riproduzione dell'organismo produttore. Tra gli SM molti prodotti fungini naturali hanno un potenziale biotecnologico come antibiotici, antimicotici o agenti antitumorali che rappresentano una fonte importante di farmaci approvati e svolgono ancora un ruolo importante nell’implementare la diversità chimica. I funghi isolati da ambienti estremi possiedono un eccellente potenziale come fonte di prodotti naturali con strutture chimiche nuove e/o insolite. La vita in un habitat stressante, come l’elevata salinità, l’elevata radiazione, le temperature e pressioni estreme e l’acidità variabile, spinge verso la produzione di composti utili alla sopravvivenza e all’adattamento a condizioni di vita sfavorevoli. La capacità biosintetica fungina degli SM risiede in sezioni del genoma microbico denominate “cluster di geni biosintetici” (BGC) costituiti da unità o moduli ripetuti che tipicamente controllano l’incorporazione di un’entità molecolare nella struttura finale. Spesso, molti BGC sono silenti in
condizioni standard di coltivazione, quindi possono essere indotti con l’uso di diversi approcci per stimolarne l’espressione con la conseguente produzione di molecole bioattive.
In questo contesto, questa tesi di dottorato è finalizzata alla ricerca di composti bioattivi secondari da fonti microbiche per trovare possibili utilizzi in campo farmaceutico. La fonte microbica ha il vantaggio di una produzione fattibile e sostenibile di grandi quantità di prodotti naturali antinfettivi mediante coltivazione su larga scala a costi ragionevoli.
In particolare, il primo obiettivo è stato quello di utilizzare lo stress osmotico nelle specie fungine alotolleranti al fine di indurre la produzione di nuovi composti bioattivi che non sono espressi in condizioni di crescita standard. È già noto che la presenza di cloruro di sodio ha il potenziale di influenzare la produzione di composti noti o la sintesi di nuovi metaboliti secondari biologicamente attivi non ancora noti. Quindi, in questo progetto di tesi di dottorato i funghi “facultative marine derived” vengono utilizzati per la scoperta e lo sfruttamento di nuove molecole bioattive, dovute all’adattamento a condizioni di crescita stressanti e allo sviluppo di percorsi biosintetici specifici.
Inoltre, lo studio dei metaboliti secondari prodotti da una nuova specie microbica aumenta le possibilità di identificare composti naturali biologicamente attivi non ancora noti per essere utilizzati nell'industria farmaceutica. Quindi, un altro obiettivo importante è stato lo studio di una nuova specie di Aspergillus per conoscerne il potenziale biosintetico di metaboliti bioattivi secondari e per ricercare nuovi composti da applicare in campo biotecnologico/farmaceutico.
Oltre al CAPITOLO 1, dove è stato descritto uno stato generale dell'arte sui metaboliti secondari fungini, nei CAPITOLI 2-5 sono state riportate procedure e disegni sperimentali.
Nel CAPITOLO 2 i funghi filamentosi sono studiati per l'attività biologica dei metaboliti secondari in diverse condizioni di stress osmotico. Per la scoperta di molecole secondarie è stato impiegato l'approccio OSMAC (One-Strain-Many-Comounds), utilizzando diverse condizioni di coltivazione come cloruro di sodio per regolare la trascrizione di geni legati a diversi metaboliti secondari. I risultati hanno mostrato che specie fungine appartenenti ai generi Penicillium, Aspergillus, Alternaria, Trichoderma e Arthrinium erano in grado di produrre estratti caratterizzati da attività biologica. Aspergillus 6C2, ulteriormente identificato come nuova specie A. olivimuriae, si distingue per la sua bioattività, mostrando attività antimicrobica contro batteri gram+, forti capacità antiossidanti e anti Quorum Sensing.
Il CAPITOLO 3 tratta della caratterizzazione morfologica e molecolare per la localizzazione tassonomica delle nuove specie di Aspergillus. Il ceppo di Aspergillus NRRL 66783 si è distinto per la sua bioattività; isolato dalla salamoia di olive, è stato identificato e caratterizzato a livello morfologico, macroscopico e microscopico, e a livello molecolare. È stato identificato con metodi molecolari che sequenziano i marcatori di identificazione della regione distanziatrice trascritta internamente all'rDNA (ITS1-5.8S-ITS2), calmodulina (CaM), β-tubulina (BenA) e la seconda subunità più grande della RNA polimerasi II (RPB2). In base alla fonte di isolamento, la nuova specie è stata denominata Aspergillus olivimuriae ed è stata individuata come la specie più basale nella sez. Flavipedi. È stato trovato tollerante ad alte concentrazioni di NaCl (15%) o saccarosio (60%) e mostra una crescita sostanziale in queste condizioni. Sebbene la nuova specie crescesse abbondantemente a 37 ° C, non è stata osservata alcuna crescita a 40 °C e i conidi in massa erano di colore marrone chiaro su tutti i terreni. L'intero genoma del fungo è stato sequenziato.
La fase finale di questo progetto di tesi di dottorato è stata trattata nel CAPITOLO 4 e riguarda lo studio di Aspergillus olivimuriae sp. nov. metaboloma secondario. Lo studio è stato condotto sia su scala genomica che attraverso l'approccio OSMAC. Al fine di prevedere il potenziale produttivo dei metaboliti secondari, è stato condotto uno studio bioinformatico dei cluster di geni biosintetici utilizzando due programmi di previsione, AntiSMASH e SMURF; l'analisi ha rivelato la presenza di cluster di geni biosintetici di metaboliti secondari noti per essere associati a tossine, composti antitumorali e antimicrobici. Parallelamente allo studio bioinformatico, Aspergillus olivimuriae è stato preliminarmente studiato per le capacità produttive dei metaboliti secondari. Attraverso l'utilizzo dell'analisi HPLC-DAD è stato studiato l'effetto induttivo per la produzione di esometaboliti dovuto all'aggiunta di sale, inibitori enzimatici e saccarosio. È stato osservato che la crescita del fungo sul sale è la condizione che più modifica il profilo metabolico di A. olivimuriae, diminuendo nettamente la produzione di composti.
Additional information
Dottorato di ricerca in Scienze, tecnologie e biotecnologie per la sostenibilità
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