In vitro evaluation of AECOPD experimental vaccine response against NTHi and Moraxella catarrhalis by using human advanced models for COPD
Author(s)
Ariolli, Andrea
Date Issued
July 14, 2023
Type
Doctoral Thesis
Abstract
Understanding host-pathogen interaction is a fundamental step in drug development and its success is often limited by the suitability of the models used to study infections. For instance, beyond ethical debates the use of animals is costly and sometimes not adequate for the desired purposes. Consequently, in the last decades the interest of industry and scientific research has been directed toward the development of innovative in vitro alternatives, pushing over traditional preclinical cell culture methods. NonTypeable Haemophilus influenzae and Moraxella catarrhalis are two common respiratory pathogens often associated with acute exacerbations in Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) and Otitis Media. The mechanisms behind the persistence of these bacteria are not yet completely understood, making their eradication complicated. The human airway epithelium is the first line of defence against inhaled pathogens, providing physical, chemical, and immunological barriers against infections. Given its characteristics, modeling this anatomical region in vitro could be useful in the characterization of mucosal infections as well as in preclinical drug evaluation. By using highly physiological in vitro models fully replicating the human airways cellular architecture, we aimed at recreating COPD-related persistent bacterial infections to mimic the chronicity stage of the disease, with the final scope of using our system to evaluate specific antibodies efficacy in counteracting bacterial pathogenesis. Traditional Air-Liquid-Interface (ALI) respiratory epithelial models’ integrity is generally limited to a relatively short timeframe after bacterial infection, representing an obstacle to the investigation of long-term bacterial persistence strategies. We hypothesized that, beyond the absence of immune system components, this limit could be related to the closed spatial configuration of the traditional ALI system. Indeed, mucociliary escalator and cellular extrusion, reported to be key defence mechanisms in pathogen clearance, are hindered by the spatial configuration of the support leading to debris accumulation and fast epithelial disruption after infection. To overcome this limit, we explored a ‘personalized’ use of the ALI system firstly described by Yonker et al. (2017), consisting in the assembly of the epithelium on the basal part of the porous membrane. Inverting the model configuration allowed us to obtain a system devoid of any physical obstacle to the natural epithelial clearance. This configuration switch did not affect tissue differentiation, as assessed by confocal microscopy analysis that highlighted the presence of key markers representative of the small airways’ cellular architecture. Moreover, according to a flow cytometry-based analysis, the inverted model resulted to be more resistant against Moraxella catarrhalis infections, apparently as a consequence of the delayed and more controlled onset of the bacterial invasion of the tissue. Interestingly, fluorescence and electron microscopy analysis revealed the ability of Moraxella catarrhalis to invade the airway epithelium according to a mechanism involving cellular invasion and formation of intra-epithelial and surface-associated biofilm-like communities. Analysis of these samples highlighted the presence of extracellular material embedding bacterial clusters and sign of macroscopical remodeling of the epithelium. Furthermore, LSCM and TEM analysis demonstrated that these biofilm-like structures are impermeant to labeling with immunoglobulins and that extracellular double strand DNA is part of the biofilm architecture. Despite exhibiting a lower invasiveness, NonTypeable Haemophilus influenzae (NTHi) was observed to persistently colonize the airway epithelium as it was detected intra- and extra-cellularly after two weeks of infection apparently without causing substantial damage and displaying different colonization phenotypes (planktonic, aggregated, biofilm-like). A reduction in overall NTHi presence in the tissue was observed after one week of infection in inverted models only, possibly as a consequence of the fact that natural clearing processes could be functional in this configuration. Finally, two different bacterial quantification strategies were explored in order to overcome biofilm-related issues encountered when applying traditional CFU counting methods; this was done with the final scope of quantifying bacterial biomass associated with the respiratory model in the presence of specific treatments intended to be used as anti-bacterial intervention strategy. This work aims to serve as a basis for future validation of organotypic ALI airway models as relevant tools to characterize infections and evaluate the efficacy of treatments against pathogen infectivity.
La comprensione dell'interazione ospite-patogeno è un passo fondamentale nello sviluppo di farmaci e il suo successo è spesso limitato dall'idoneità dei modelli utilizzati per studiare le infezioni. Per esempio, al di là dei dibattiti etici, l'uso degli animali è costoso e talvolta non adeguato agli scopi desiderati. Di conseguenza, negli ultimi decenni l'interesse dell'industria e della ricerca scientifica si è indirizzato verso lo sviluppo di innovative alternative in vitro, superando i tradizionali metodi di coltura cellulare utilizzati generalmente nella ricerca preclinica. Nontypeable Haemophilus influenzae e Moraxella catarrhalis sono due comuni patogeni respiratori spesso associati a esacerbazioni acute nella broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) e nell'otite media. I meccanismi alla base della persistenza di questi batteri non sono ancora completamente chiariti, rendendo complicata la loro eradicazione. L'epitelio delle vie aeree umane è la prima linea di difesa contro gli agenti patogeni inalati, fornendo barriere fisiche, chimiche e immunologiche contro le infezioni. Date le sue caratteristiche, la riproduzione in vitro di questa regione anatomica potrebbe essere utile nella caratterizzazione delle infezioni della mucosa respiratoria e nella valutazione preclinica dei farmaci. Utilizzando modelli in vitro fisiologici che riproducono pienamente l'architettura cellulare delle vie aeree umane, abbiamo cercato di ricreare le infezioni batteriche persistenti legate alla BPCO per imitare lo stadio di cronicità della malattia, con l'obiettivo finale di utilizzare il nostro sistema per valutare l'efficacia di anticorpi specifici nel contrastare la patogenesi batterica. L'integrità dei modelli epiteliali respiratori tradizionali su transwell (Air-Liquid-Interface, ALI) è generalmente limitata a un lasso di tempo relativamente breve dopo l'infezione batterica, il che rappresenta un ostacolo allo studio di strategie di persistenza batterica a lungo termine. Abbiamo ipotizzato che, oltre all'assenza di componenti del sistema immunitario, questo limite possa essere legato alla configurazione spaziale chiusa del sistema ALI tradizionale. In effetti, l'escalation mucociliare e l'estrusione cellulare, riportati essere meccanismi di difesa chiave nella clearance dei patogeni, sono ostacolati dalla configurazione spaziale del supporto che porta all'accumulo di detriti e alla rapida rottura dell'epitelio dopo l'infezione. Per superare questo limite, abbiamo esplorato un uso "personalizzato" del sistema ALI descritto per la prima volta da Yonker et al. (2017), che consiste nell'assemblare l'epitelio sul lato basale della membrana porosa. L'inversione della configurazione del modello ci ha permesso di ottenere un sistema privo di qualsiasi ostacolo fisico alla naturale clearance epiteliale. Questo cambio di configurazione non ha influenzato la differenziazione del tessuto, come valutato dall'analisi in microscopia confocale che ha evidenziato la presenza di marcatori chiave rappresentativi dell'architettura cellulare delle piccole vie aeree. Inoltre, secondo un'analisi basata sulla citometria a flusso, il modello invertito è risultato più resistente alle infezioni da Moraxella catarrhalis, apparentemente come conseguenza dell'inizio ritardato e più controllato dell'invasione batterica del tessuto. È interessante notare che le analisi di fluorescenza e microscopia elettronica hanno rivelato la capacità di Moraxella catarrhalis di invadere l'epitelio delle vie aeree secondo un meccanismo che prevede l'invasione cellulare e la formazione di comunità simili a biofilm intraepiteliali e associati alla superficie. L'analisi di questi campioni ha evidenziato la presenza di materiale extracellulare che incorpora aggregati batterici e segni di rimodellamento macroscopico dell'epitelio. Inoltre, le analisi LSCM e TEM hanno dimostrato che queste strutture simili a biofilm sono impermeabili allo staining con immunoglobuline e che il DNA extracellulare a doppio filamento fa parte dell'architettura del biofilm. Nonostante la minore invasività, si è osservato che Haemophilus influenzae non tipizzabile (NTHi) colonizza in modo persistente l'epitelio delle vie aeree, poiché è stato rilevato a livello intra ed extracellulare dopo due settimane di infezione, apparentemente senza causare danni sostanziali e mostrando diversi fenotipi di colonizzazione (planctonici, aggregati, simili a biofilm). Una riduzione della presenza complessiva di NTHi nel tessuto è stata osservata solo dopo una settimana di infezione nei modelli invertiti, forse come conseguenza del fatto che i processi di clearing naturale potrebbero essere funzionali in questa configurazione. Infine, sono state esplorate due diverse strategie di quantificazione batterica per superare i problemi legati al biofilm riscontrati nell'applicazione dei metodi tradizionali di conteggio delle CFU; ciò è stato fatto con lo scopo finale di quantificare la biomassa batterica associata al modello respiratorio in presenza di trattamenti specifici destinati a essere utilizzati come strategia di intervento antibatterico.
Additional information
Dottorato di ricerca in Scienze, tecnologie e biotecnologie per la sostenibilità
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