Development of new tools for on-site detection of Spiroplasma citri, the causal agent of citrus stubborn disease
Author(s)
Drais, Munira Inas
Date Issued
March 19, 2018
Type
Doctoral Thesis
Abstract
This research concerns the development of new tools for the on-site detection of Spiroplasma citri the causal agent of citrus Stubborn Disease (CSD). Firstly, a Direct Tissue Blot ImmunoAssay (DTBIA), which consist on the transfer of protein antigens from a freshly cut tissue surface to nitrocellulose membrane, that are reacting with enzyme-labelled antigen-specific antibodies, was developed to allow the mass detection of the causal agent of the CSD. The developed protocol was validated through a field survey on two citrus varietal collections located in the main Algerian citrus growing areas. This investigation consented to detect two S. citri infected trees among the tested samples. The obtained results and the efficiency of the test were confirmed by molecular assays. The molecular characterization of the newly detected Algerian S. citri isolate, evidenced 99% nucleotide homology of the spiralin gene with the Iranian fasa I, isolated from a leafhopper vector. Interestingly, the Algerian isolate also reacted positively with the primer pairs, targeting the TraG gene, which is essential for insect transmission and predicts a natural diffusion of the pathogen in the case of the presence of insect vectors. Following these findings, a monitoring of the putative insect vectors of S. citri, was carried out in the previously surveyed area, in order to evaluate their presence. Fortunately, among the captured and identified insects, none of them was reported as possible vector of this pathogen.
Furthermore, the development and application of the innovative Loop Mediated Isothermal Amplification detection techniques to S. citri, was also performed. In this context, a rapid method of crude plant extract preparation from infected trees was developed for on-site testing. The developed LAMP assay targeting the spiralin gene showed high specificity to S. citri and detected DNA at 70 fg/μl, with no crude plant extract inhibition. This isothermal assay was validated in open field using a portable BioRanger device. The LAMP assay detection diagnostic reliability of the on-site procedure was shown to be 100%, efficient, considering that all the tested samples, originated from different cultivars, showed similar results with the qPCR assay detection.
Finally, the genetic diversity among the Mediterranean and American S. citri isolates was investigated. In this framework, spiralin gene sequences of eleven isolates were obtained and analyzed. The comparison of the translated amino acid, confirmed the presence of conserved region in all the tested isolates.
Questa ricerca ha riguardato lo sviluppo di nuovi strumenti per la diagnosi in-situ di Spiroplasma citri, l'agente causale della malattia dello “Stubborn” degli agrumi (Citrus Stubborn Disease, CSD). In primo luogo, è stato messo a punto il metodo di diagnosi massale Direct Tissue Blot ImmunoAssay (DTBIA), che consiste nel trasferimento di antigeni proteici da una sezione di tessuto appena tagliata su una membrana di nitrocellulosa, e successiva aggiunta di anticorpi marcati con enzima specifici per S. citri. Il protocollo sviluppato è stato applicato per la validazione nel monitoraggio in campo su due collezioni varietali di agrumi site in importanti aree agrumicole Algerine. L’indagine ha consentito di rilevare la presenza di due piante infette da S. citri tra i campioni saggiati. I risultati ottenuti e l'efficienza del test sono stati confermati dai risultati dei saggi molecolari. La caratterizzazione molecolare del gene spiralina dei due isolati di S. citri Algerini ha evidenziato un'omologia di sequenza nucleotidica del 99% con il corrispondente gene dell’isolato Iraniano fasa I, ottenuto da cicalina vettrice del patogeno. È interessante notare che l'isolato Algerino è stato identificato anche dalle coppie di primer che rilevano il gene TraG, che è essenziale per la trasmissione, suggerendo quindi la sua potenziale diffusibilità in natura in presenza di insetti vettori. A seguito dei risultati ottenuti, è stato effettuato uno studio sui potenziali insetti vettori di S. citri presenti nella zona monitorata. Fortunatamente, tra gli insetti catturati ed identificati, nessuno era segnalato come potenziale vettore di questo patogeno.
Inoltre, è stata messa a punto una procedura diagnostica con il metodo LAMP per lo S. citri. A questo scopo è stato sviluppato un metodo rapido di preparazione degli estratti vegetali grezzi per il saggio in-situ. Il saggio LAMP sviluppato per il gene spiralina ha mostrato un'elevata specificità per S. citri e ha rilevato DNA a concentrazioni di 70 fg/μl, senza alcuna inibizione da parte dell’estratto grezzo della pianta. Questo test isotermico è stato validato in pieno campo utilizzando un dispositivo BioRanger portatile. I campioni testati sono stati prelevati da cultivar diverse e le analisi qPCR del saggio LAMP in-situ hanno dato risultati simili a quelli ottenuti con la LAMP tradizionale, rivelandosi pertanto totalmente affidabili.
Infine, è stata studiata la variabilità genetica tra gli isolati di S. citri mediterranei e quelli americani. A questo scopo sono state analizzate sequenze del gene spiralina di undici isolati. Dal confronto delle sequenze amminoacidiche è stato confermato che il gene spiralina contiene una zona conservata che non varia nei diversi isolati.
Additional information
Dottorato di ricerca in Scienze delle produzioni vegetali e animali
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