Sviluppo di metodiche molecolari per il rilevamento rapido di Pseudomonas in matrici alimentari e ambientali

Abstract

Il genere Pseudomonas include batteri gram negativi aerobi, eterotrofi, che sono particolarmente versatili dal punto di vista metabolico e sono in grado di contaminare un ampio spettro di alimenti (latticini, uova, pesce, carne e vegetali) e di determinarne il deterioramento. Alcune forme, ascrivibili alle specie Pseudomonas aeruginosa e Pseudomonas fluorescens, possono essere patogeni opportunistici per piante, animali ed esseri umani e, data la loro capacità di formare biofilm, risultano spesso resistenti a trattamenti con antibiotici ad ampio spettro. Tradizionalmente l’identificazione e caratterizzazione di Pseudomonas viene condotta utilizzando test fenotipici classici come crescita su terreni specifici, reazioni enzimatiche ed analisi morfologica e microscopica. Questi metodi oltre a richiede tempo talvolta non permettono di effettuare identificazioni precise in particolare per ceppi appartenenti a specie eterogenee come P. fluorescens, P. putida e P. syringae (Grimont et al., 1996). Questo progetto di dottorato ha riguardato pertanto lo sviluppo di metodiche molecolari innovative per identificare e tracciare la presenza di microrganismi appartenenti al genere Pseudomonas in matrici alimentari e ambientali. Utilizzando primers specifici per il DNA ribosomiale 16S, è stato possibile discriminare, mediante PCR, batteri appartenenti al genere Pseudomonas da altre forme microbiche. In parallelo è stato sviluppato un protocollo di multiplex PCR, basato sull’amplificazione simulatanea dei geni per il 16S rRNA e per la subunità beta della RNA polimerasi (rpoB) che ha permesso di aumentare la specifica del test molecolare e di discriminare i Pseudomonas da batteri appartenenti a generi strettamente correlati da un punto di vista tassonomico (come ad esempio i Marinomonas). Il protocollo di PCR specifico per il DNA ribosomiale 16S in combinazione con la tecnica della T-RFLP ha permesso di effettuare identificazioni tassonomiche a livello di specie senza ricorrere a procedure di prearricchimento o all’isolamento e alla coltivazione in piastra dei ceppi ambientali. È stato anche sviluppato un protocollo di PCR real-time, avente come bersaglio il DNA ribosomiale 16S, che ha permesso di aumentare la sensibilità e la rapidità del test diagnostico che, partendo da DNA, può essere eseguito in circa 30 minuti. Infine è stato messo a punto un protocollo di RFLP-PCR, specifico per il gene che codifica la subunità B della DNA girasi (gyrB), che è risultato utile per l’identificazione rapida di batteri appartenenti alla specie P. aeruginosa: patogeni opportunistici ben noti per la loro capacità di crescere in acqua distillata e di sopravvivere nei disinfettanti e che comunemente sono utilizzati come indicatore per valutare la qualità delle acque destinate al consumo umano. Prove condotte su campioni di DNA ambientale di diversa provenienza (metagenoma della comunità microbica presenti in reattori biologici a cellule adese, scarti agricoli e latte contaminato) hanno permesso di dimostrare che le metodiche molecolari sviluppate nell’ambito di questo progetto di dottorato sono più accurate di quelle precedentemente descritte in letteratura.

Main goal of this PhD project was to develop a rapid, efficient and sensitive procedures to identify and trace dissemination of pathogenic and spoilage Pseudomonas species in foods and environments. In this work, the molecular identification of Pseudomonas species was achieved using new PCR-based assays with primer sets specific for 16S ribosomal DNA, rpoB and gyrB genes. These PCR assays were found to provide highly genus-specific detection and could be successfully used to identify Pseudomonas in microbial consortia where these bacteria were not abundant. By coupling the PCR assay for 16S rDNA gene to a T-RFLP technique, identification of Pseudomonas strains at species level could be obtained without cultivation. PCR with a combination of two target sequences (multiplex PCR) appeared to be the optimum choice for discriminating between Pseudomonas and closely related genera. Finally, we demonstrated that direct detection and identification of P. aeruginosa in environmental samples can be achieved using a PCR technique based on the detection of gyrB. RFLP analysis of this latter gene can be also used for discriminating between P. aeruginosa and P. putida/P. fluorescens species.