Analysis of the role of werner helicase interacting protein 1 in response to replication stress

Abstract

Genome instability is a common feature of cancer cells. Most of the chromosomal abnormalities arising in tumours come from defective DNA replication (Abbas et al., 2013; Aguilera and Gómez-González, 2008; Branzei and Foiani, 2010; Zeman and Cimprich, 2014). For this reason, accurate handling of stalled replication forks is of paramount importance for the maintenance of genome stability. Recently, it has been demonstrate that RAD51 recombinase is involved in protecting stalled replication forks from nucleolytic attack by MRE11, which otherwise can seriously threaten genome stability (Hashimoto et al., 2010; Schlacher et al., 2011). However, the identity of other factors that can collaborate with RAD51 in this task and how this pathway operates are still poorly elucidated. In this study, we have identified a previously uncharacterized function of the human Werner helicase interacting protein 1 (WRNIP1) as a factor working in conjunction with the RAD51 recombinase in response to replication stress. We show that WRNIP1 is directly involved in protection and restart of stalled replication forks following replication stress. We also demonstrated that WRNIP1 is required for preventing uncontrolled MRE11-mediated degradation of nascent DNA strand at stalled replication forks. WRNIP1 depletion results in a large enhancement of parental-strand ssDNA accumulation produced by the action of MRE11 nuclease activity, but it does not lead to a greater amount of RAD51 bound to chromatin. Thus, WRNIP1-deficient cells show an overt RAD51 destabilization after fork stalling. We establish that WRNIP1 is directly recruited to stalled replication forks and cooperates with RAD51 to safeguard fork integrity, by promoting RAD51 stabilization on ssDNA. We further demonstrate that replication fork protection does not require the ATPase activity of WRNIP1 that is however essential to achieve the recovery of perturbed replication forks. Loss of WRNIP1 or its catalytic activity exhibit high sensitivity to HU-induced fork stalling, leading to DNA damage accumulation and cell death, and that unprotected stalled forks is responsible for chromosomal instability arising, after fork stalling, specifically in WRNIP1-deficient cells. Interestingly, downregulation of the anti-recombinase FBH1, which promotes the removal of RAD51 from chromatin, can compensate for loss of WRNIP1 activity. Indeed, attenuation of replication fork degradation and chromosomal aberrations have been observed in WRNIP1-deficient cells after FBH1 depletion, due to enhancement of the amount of RAD51 chromatin-bound. Consistently, over-expression of RAD51 in WRNIP1-deficient cells counteracts stalled replication fork degradation. Therefore, our results clearly indicate that WRNIP1 plays a crucial role in stabilizing RAD51 to stalled forks, protecting them from the MRE11-dependent degradation. Furthermore, we establish that WRNIP1 is implicated in the stalled fork resumption through its ATPase activity. Altogether, our work suggests a molecular basis for the role of human WRNIP1 in safeguarding genome stability in response to replication stress. In particular, they unveil a unique role for WRNIP1 as a replication fork-protective factor in maintaining genome stability.

La corretta replicazione del DNA rappresenta una questione di cruciale importanza per la vita di una cellula. Tuttavia, diversi fattori, sia esogeni sia endogeni, possono interferire con il normale processo di replicazione del DNA, causando l’arresto delle forche di replicazione. Questo fenomeno, conosciuto come “stress replicativo”, è considerato la causa principale dell’instabilità genomica, che è la principale causa di insorgenza di cancro nell’uomo. Per contrastare questa minaccia, la cellula ha sviluppato un complesso sistema di risposta allo stress replicativo. Infatti la cellula blocca provvisoriamente il ciclo cellulare e stabilizza le forche di replicazione attive per fornire il tempo necessario a rimuovere la causa che ha determinato l’arresto della replicazione. Recentemente, è stato dimostrato che la proteina ricombinasi RAD51 svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento della stabilità genomica, proteggendo le forche di replicazione bloccate da una degradazione incontrollata che dipende dalla nucleasi MRE11. Tuttavia, nonostante i numerosi sforzi, non è stato completamente chiarito come RAD51 opera durante il ripristino delle forche arrestate e quali siano i partner con i quali collabora in questo cruciale processo di protezione. Il nostro studio rivela un nuovo ruolo di Werner Helicase Interacting Protein 1 (WRNIP1) nel mantenimento della stabilità genomica in risposta allo stress replicativo. WRNIP1 risulta essere fondamentale nel recupero e nel ripristino delle forche di replicazione arrestate in risposta a stress replicativo, e per questo richiede la sua attività ATPasica. Inoltre WRNIP1 collabora con la ricombinasi RAD51 per proteggere le forche di replicazione stallate. In particolare, WRNIP1 viene reclutato direttamente alla forca di replicazione in seguito a stallo della replicazione. In questa sede promuove la stabilizzazione di RAD51, prevenendo la degradazione incontrollata del filamento di DNA nascente da parte di MRE11. Consistentemente, la perdita di WRNIP1 produce un grande accumulo di regioni a singolo filamento sul DNA parentale (parental-ssDNA), che derivano dall’attività nucleasica di MRE11, al quale non corrisponde una maggiore quantità di RAD51 caricata in cromatina, o più specificatamente alla forca di replicazione. Inoltre, dal momento che la perdita di WRNIP1 porta ad una mancata capacità di protezione delle forche di replicazione bloccate, la cellula accumula inevitabilmente alti livelli di danno al DNA e di aberrazioni cromosomiche, che dimostra direttamente quanto sia importante il ruolo che questa proteina svolge nel mantenimento della stabilità del genoma. E’ stato interessante notare che la deplezione di FBH1, che è una proteina anti-ricombinasi che favorisce la rimozione di RAD51 dai filamenti di DNA, annulla il fenotipo associato alla perdita di funzione di WRNIP1 nelle cellule, contrastando la degradazione della forca di replicazione stallata mediata da MRE11. In maniera consistente, i livelli di danno al DNA e di aberrazioni cromosomiche diminuiscono nelle cellule WRNIP1-deficienti in cui FBH1 è stato depletato. Allo stesso modo, la over-espressione di RAD51 in cellule WRNIP1-deficienti contrasta la degradazione della forca di replicazione stallata. In conclusione, questo studio indica che WRNIP1 previene la degradazione patologica delle forche di replicazione stallate mediata da MRE11. Inoltre, i nostri risultati mostrano che WRNIP1 svolge la sua funzione di protezione delle forche di replicazione attraverso la stabilizzazione di RAD51 sul filamento di DNA. Nel suo insieme questo studio fornisce le basi molecolari per comprendere la funzione che la proteina umana WRNIP1 svolge nel mantenimento dell’integrità genomica quando la cellula viene sottoposta a stress replicativo.