Characterization of species-specific and tumor-related differences in p53 centrosomal localization and activities

Abstract

The centrosome is the major microtubule-organizing center in animal cells and consists of two centrioles surrounded by pericentriolar material (PCM). Like DNA, the centrosome duplicates once per cell cycle and in mitosis the two centrosomes form the poles of the mitotic spindle, which segregates the chromosomes into the two daughter cells. Numeral abnormalities of centrosomes (centrosome amplification) occur frequently in cancer, and are considered to be the major cause of chromosome instability (CIN) which accelerates acquisition of malignant phenotypes during tumor progression. Recent studies have shown that several proteins involved in the DNA damage response localize at the centrosomes and regulate cell cycle and centrosome duplication cycle. Among them, the tumor suppressor p53 was shown to localize at the centrosomes and to prevent numerical centrosome alterations by controlling centrosome duplication and cytokinesis process (Tarapore 2002; Shinmura 2007; Fukasawa 2008). However, these observations have been made in mouse cells, in which loss of p53 induces centrosome amplification and CIN, but not in normal human cells (NHCs). We have previously demonstrated that p53 localizes at the centrosome in NHCs at each mitosis (i.e., p53 mitotic centrosomal localization, p53-MCL) in a microtubule- and ATM-dependent manner (Ciciarello 2001; Tritarelli 2004; Prodosmo 2013). Nevertheless, the role of p53 at the centrosome in NHCs is still undeterminated, although we know that loss of p53 alone does not induce centrosome amplification and CIN as in mouse cells, suggesting different p53 centrosomal activities in mice and humans (Kawamura 2006). Here we show a different mechanism of regulation and localization of p53 at the centrosomes in human vs. mouse cells. In contrast with human cells, we show that in mouse cells endogenous p53 is constitutively present at the centrosome in a microtubule- and ATM-independent manner. Moreover, we show that different cell cycle-related localization of p53 at the centrosomes in mouse and human cells is also associated with different functional activities of p53. In this sense, we analyzed the effects of p53 depletion in normal human (HF) and murine (MEF) fibroblasts. In MEFs we observed the presence of centrosome amplification due to both overduplication and cytokinesis failure as expected after loss of p53 (Tarapore 2002; Fukasawa 2008). At variance, in HFs we observed loss of spindle integrity and mitotic catastrophe, rather than centrosome amplification, but only after inhibition of p53-MCL gained upon strong p53 depletion (i.e., upon double p53 interference). In addition, we showed that human tumor cells, U2OS, succeed in overcoming these centrosome-associated p53 controls. Indeed, p53-depleted cells U2OS show abnormal centrosome number and accumulation of bi- and multi-nucleated cells. Overall, our data indicate the existence of species-specific and also tumor-related differences in centrosome-associated p53 activities.

Il centrosoma, il principale centro di organizzazione dei microtubuli nelle cellule animali, è un organello citoplasmatico in prossimità del nucleo che si compone di due centrioli circondati da materiale proteico definito materiale pericentriolare (PCM). Come il DNA, il centrosoma duplica una sola volta per ciclo cellulare e durante la mitosi i due centrosomi formano i poli del fuso mitotico, che separa i cromosomi nelle due cellule figlie. Anomalie nel numero di centrosomi sono state osservate in molti tumori, caratterizzati da amplificazione centrosomale, e sono considerate la principale causa di instabilità cromosomica (CIN), che accelera l'acquisizione del fenotipo maligno durante la progressione tumorale. Recenti studi hanno dimostrato che diverse proteine coinvolte nella risposta al danno al DNA localizzano al centrosoma e regolano sia il ciclo cellulare che il ciclo di duplicazione dei centrosomi. Tra queste proteine è stato dimostrato che l’oncosoppressore p53 localizza al centrosoma e ha un ruolo nella regolazione della duplicazione dei centrosomi e nel processo di citochinesi (Tarapore & Fukasawa 2002, 2008; Shinmura et al., 2007). In particolare, è stato dimostrato che in cellule murine la perdita di p53 induce amplificazione centrosomale e CIN. Nelle cellule umane normali (NHCs), in cui abbiamo precedentemente dimostrato che p53 localizza al centrosoma ad ogni mitosi (p53-MCL) (Ciciarello et al, 2001; Tritarelli et al ., 2004; Prodosmo et al., 2013), è stato osservato che la sola perdita di p53 non induce amplificazione centrosomale e CIN come nelle cellule murine, suggerendo l’esistenza di una diversa attività di p53 al centrosoma nel topo e nell'uomo (Kawamura et al., 2006). Nella prima parte di questo lavoro descriviamo un diverso meccanismo di regolazione e localizzazione di p53 al centrosoma nel topo e nell’uomo. In contrasto con le cellule umane, dimostriamo che nelle cellule murine la p53 endogena è costitutivamente presente al centrosoma in una maniera indipendente dai microtubuli e dalla chinasi ATM. Inoltre, abbiamo dimostrato che la diversa localizzazione di p53 ai centrosomi nel topo e nelle cellule umane è associata a diverse attività funzionali di p53. In questo senso, abbiamo analizzato gli effetti della deplezione di p53 in fibroblasti normali umani (HF) e in fibroblasti normali murini (MEF). Nelle cellule MEF interferite per p53 abbiamo osservato la presenza di amplificazione centrosomale dovuta sia a difetti nel processo di duplicazione dei centrosomi (iperduplicazione centrosomale) che a difetti nel processo di citochinesi, come già dimostrato in letteratura (Tarapore & Fukasawa 2002; Fukasawa 2008). Al contrario, nelle cellule HF interferite per p53 non abbiamo osservato amplificazione centrosomale, ma piuttosto una perdita dell’integrità del fuso mitotico seguita da catastrofe mitotica. In particolare, abbiamo osservato che questo difetto in metafase si manifesta solo a seguito di una profonda inibizione di p53, che permette di inibire la localizzazione di p53 al centrosoma, che è risultata essere molto stabile. Nella seconda parte del lavoro abbiamo dimostrato che cellule tumorali umane, come le U2OS, non rispondono all’inibizione di p53 allo stesso modo delle cellule normali. Infatti, le U2OS interferite per p53 mostrano amplificazione centrosomale, “disengagement” dei centrioli e accumulo di cellule bi- e multi-nucleate. Nel complesso, i nostri dati indicano sia l'esistenza di differenze specie-specifiche nella localizzazione e attività di p53 al centrosoma, che l’esistenza di differenze legate al processo di trasformazione neoplastica nelle cellule umane.