Il DNA Barcoding come strumento preliminare e speditivo per approfondimenti sistematici, valutazione della biodiversità e biomonitoraggio

Abstract

L'accurata identificazione degli organismi acquatici è una prerogativa fondamentale per le ricerche applicate alla biodiversità o al biomonitoraggio delle acque. In questo lavoro, viene presentata una panoramica sulle potenzialità applicative e la relativa efficacia dell'approccio DNA barcoding in due casi di studio distinti: 1) l'identificazione delle specie di Efemerotteri, un gruppo tassonomico chiave per il biomonitoraggio dei corpi idrici in tutto il mondo; 2) la variabilità genetica di due specie ittiche, Engraulis encrasicolus e Sardina pilchardus presenti in alcuni prodotti commerciali come il bianchetto. L'obiettivo finale è quello di creare una banca dati regionale che progredisca a scale nazionale e continentale come base statisticamente valida in grado di permettere misurazioni ripetute di biodiversità con una risoluzione sufficientemente utile a monitorare l’ecologia delle acque sia marine che dolci. Il metodo Barcoding è stato applicato a 39 specie di Efemerotteri e 44 individui delle due specie marine. La discriminazione dei campioni e l'identificazione delle specie sono stati valutati attraverso l’identità o la similarità aplotipica, la verifica del barcoding-gap tra specie, le stime della monofilia e la corretta congruenza specie/sequenza sulle banche dati di riferimento disponibili. Il potere risolutivo dei dati ottenuti è stato discusso utilizzando strumenti statistici come Spider, un pacchetto di R, Ptp (Poisson Tree Proess) e dendrogrammi generati da specifici strumenti bioinformatici. Sia per gli Efemerotteri che per le due specie ittiche sono stati raggiunti elevati livelli di identificazione specifica con tutte le metodologie utilizzate. Pertanto, il DNA barcoding si è dimostrato uno strumento utile per migliorare la ricerca tassonomica degli Efemerotteri del Mediterraneo, ponendo l’attenzione sulla presenza di eventuali specie criptiche da verificare con strumenti e tecniche più approfondite ed evidenziando la necessità di aggiornare le attuali conoscenze per questo gruppo tassonomico. E’ stato quindi testato un approccio di metabarcoding ambientale per questi due casi di studio attraverso la tecnica Next Generation Sequencing, per verificarne l’efficienza ai fini del monitoraggio biologico e commerciale. I risultati ottenuti hanno evidenziato la capacità della tecnica nel rilevare una buona parte dei taxa presenti in una comunità naturale, anche se la presenza di alcune distorsioni evidenziate in tutte le library richiederà ulteriori esperimenti e modifiche ai disegni sperimentali. Questo nuovo sistema di informazioni (eDNA), opportunamente impostato ed integrato con una banca dati di riferimento locale e con descrittori di habitat ecologici, potrebbe migliorare gli sforzi di gestione sulla conservazione degli ecosistemi acquatici fornendo la precisione necessaria per attuare programmi di valutazione della qualità delle acque.

Accurate identification of aquatic organisms is a fundamental prerogative to research applied to water biodiversity and biomonitoring. In this work, an overview of the potential applications and the relative effectiveness of the DNA barcoding approach on two distinct case studies is presented: 1) the identification of the species of Ephemeroptera, a key taxonomic group for biomonitoring of water bodies worldwide; 2) the genetic variability of two fish species, Engraulis encrasicolus and Sardina pilchardus, components of some commercial products such as “bianchetto”. The final objective is to set up a regional database that progresses to national and continental scales as a statistically sound basis for cost efficient and repeated measurements of biodiversity, with sufficient resolution to be useful to monitor marine and fresh-water ecology. The barcoding method was applied to 39 Ephemeroptera species and 44 individuals of the two marine species. Sample discrimination and species identification were investigated by evaluating haplotype identity and similarity, intra-/interspecific genetic distances, optimal identification of barcoding gap thresholds, estimates of species monophyly and comparative species matches on available reference libraries. The resolving power of the obtained data was discussed in the light of statistical tools such as Spider R-package, Ptp (Poisson Tree Processes) and dendrograms generated by specific bioinformatics tools. For both Ephemeroptera and the two fish datasets, high levels of species identification were achieved with all the used methodologies. In particular, DNA barcoding showed to be a powerful tool to improve the taxonomic research of Mediterranean Ephemeroptera, further indicating the occurrence of potential cryptic species and highlighting the need for more in-depth studies aimed at updating the current knowledge for this taxonomic group. Finally, a DNA metabarcoding approach on environmental samples (eDNA) for the two case studies was tested to verify its efficiency for biomonitoring and market quality control through the Next Generation Sequencing approach. The obtained results demonstrated the ability of the technique to detect a large proportion of the taxa present in a natural community, although the presence of some distortions was highlighted. This methodology, althoguh highly promising, will therefore require further experiments and modifications to the experimental designs for a routine application. This new information system (eDNA), properly set and integrated with a local reference database with descriptors of ecological habitats, could improve management efforts on the conservation of aquatic ecosystems, providing the accuracy required to implement the evaluation programs of water quality.