Effetti a livello fenotipico, citogenetico e genomico conseguenti all'introgressione in frumento duro di segmenti cromosomici della specie affine Thinopyrum ponticum

Abstract

Per far fronte alle numerose sfide che l’ingegneria genetica del frumento sta ad oggi incontrando, come ad esempio i cambiamenti climatici e l’aumento della domanda alimentare, un approccio promettente consiste nell’aumentare la base genetica delle culture ricorrendo ai geni “alien” delle specie selvatiche affini al frumento. Infatti, recenti progressi nell’ingegneria cromosomica, grazie ai quali segmenti di cromosomi estranei possono essere trasferiti ai cromosomi di frumento, consentono di avere come target anche caratteri complessi, come quelli legati all’architettura del sistema radicale, che sono di grande importanza per le performance di resa delle specie coltivate. Studi precedenti su tre linee ricombinanti quasi-isogeniche frumento duro-Thinopyrum ponticum (NIRLs) aventi porzioni distali del braccio 7AL sostituito per il 23%, 28% e 40% da porzioni omeologhe del braccio 7AgL del Th. ponticum (rispettivamente R5, R112 e R23), hanno indicato la presenza di QTL che contribuiscono alla resa. Nel presente studio sono state valutate l’architettura radicale e la biomassa della radice e del germoglio delle NIRLs. Lo studio è stato condotto utilizzando due differenti micro-metodi, paper no-roll (PNR) e rizotroni (RHZ). I risultati ottenuti da entrambi i metodi hanno mostrato che la presenza di porzioni del 7AgL incrementavano significativamente molti dei caratteri radicali coinvolti nelle performance di resa e nel reperire nutrienti nelle tre NIRLs rispetto alle loro linee di controllo mancanti del segmento 7AgL. In particolare, la presenza del 5% del 7AgL segmento che differenzia le NIRL con il 28% di 7AgL da quella con il 23% di 7AgL, determina un significativo incremento di molti dei caratteri analizzati, come l’angolo di diffusione radicale (+17% e +37% con PNR e RHZ, rispettivamente), il diametro medio della radice (+14 e +34%), la biomassa radicale (+31 e +38) e la lunghezza dell’apparato radicale. I risultati ottenuti permettono di dissezionare funzionalmente il 40% di 7AgL che include il contenuto selvatico delle tre NIRLs, e, quindi, di associare a definite porzioni del 7AgL il controllo genetico di diversi caratteri radicali. La medesima indagine comparativa è stata condotta in linee di frumento tenero- Th. ponticum, quali la linea di traslocazione T4 (7DS.7DL/7AgL; il segmento 7AgL di questa linea include quelli presenti nelle 3 NIRLs di frumento duro) e la linea KS24, caratterizzata dal 7AgL di un’altra accessione del Th. ponticum (denominato 7el2L). Le prove condotte in frumento tenero hanno confermato la specificità degli alleli 7AgL nel determinare il contributo positivo ai caratteri del RSA analizzati. Sono state condotte ulteriori indagini, con il metodo paper roll (PR), sulle stesse linee di ricombinazione/traslocazione di frumento duro e tenero riguardanti l’architettura e la biomassa dell’apparato radicale in condizioni di stress idrico. È stato confermato il contributo positivo dei segmenti 7AgL per i caratteri dell’RSA anche in condizioni di acqua limitata (in particolare per la biomassa e i parametri relativi alla lunghezza dell’apparato radicale). Un ulteriore aspetto che gli stessi materiali sopra descritti hanno permesso di analizzare, ha riguardato alterazioni di tipo epigenetico (in particolare la metilazione del DNA) potenzialmente conseguenti all’introduzione di materiale genetico estraneo nel genoma di frumento duro. Poco si conosce sugli effetti epigenetici conseguenti al trasferimento di limitate quantità di materiale genetico da specie selvatiche affini, soprattutto dopo diverse generazioni dalla creazione di tali “ibridi parziali”. Per la valutazione di tali modificazioni, è stato impiegato un saggio immunologico vs 5-mC ed il metodo MSAP (Methylation Sensitive Amplification Polymorphism) in differenti tessuti (foglia, antere) e fasi fisiologiche (Z1.3, Z2.2-Z2.3, I e II divisione mitotica della micro-gametogenesi) delle linee ricombinanti frumento duro-Th. ponticum. In particolare il metodo MSAP ha consentito, mediante l’impiego di tre differenti enzimi con diversa sensibilità alle citosine metilate (EcoRI; MspI; HpaII) ed 8 coppie di primers selettivi, di effettuare sia un analisi quantitativa, sia sequenza-specifica delle variazioni di metilazione nelle quattro fasi di sviluppo ed anche tra le linee ricombinanti (HOM+) ed i relativi controlli (non portatori dei segmenti 7AgL, HOM-). Entrambi gli approcci hanno evidenziato una conservazione di ~ 90% dei profili di metilazione nelle NIRLs, sia HOM+ che HOM-, anche se è stata riscontrata una iper-metilazione associata alla presenza dei segmenti selvatici. Attraverso il sistema MSAP sono stati analizzati 574 siti “CCGG” che hanno mostrato una differente metilazione sia in relazione del tessuto ed alla fase di sviluppo ma anche in relazione ai 3 segmenti 7AgL; associati alla presenza/assenza del 7AgL sono stati identificati 173 polimorfismi di metilazione, di cui 123 erano attribuibili al ricombinante R23. Questo ricombinante ha mostrato, qualitativamente e quantitativamente, le principali alterazioni di metilazione rispetto alle NIRLs R5 e R112. I risultati ottenuti hanno indicato che gli effetti sulla metilazione del DNA a livello genome-wide in questi genotipi derivanti da trasferimento interspecifico di segmenti cromosomici di limitate entità sono nel complesso limitati, almeno alla generazione BC4-5F7; è stata comunque evidenziata una proporzionalità tra dimensioni dei segmenti 7AgL trasferiti e l’entità delle alterazioni nel pattern di metilazione ed in fine per la linea ricombinante R23 è stato ipotizzato il possibile coinvolgimento del gene Sd (Segregation distortion), presente solo nel 12% 7AgL esclusivo della R23, nelle più marcate modificazioni epigenetiche osservate nella NIRL R23 HOM+.

To meet the numerous challenges that wheat breeding is facing today, such as climate changes and rise in global food demand, a promising approach consists of widening the crop genetic basis by resorting to alien genes from wild wheat relatives. In fact, recent progress in chromosome engineering, through which alien chromosome segments can be transferred to wheat chromosomes, enables targeting of even complex traits, such as those underlying root system architecture, that are of great importance for yield performance of crop species. Previous studies on three durum wheat-Thinopyrum ponticum near-isogenic recombinant lines (NIRLs), containing 23%, 28% and 40% of their distal 7AL arm replaced by homoeologous portions of the alien 7AgL arm of the Thinopyrum ponticum (R5, R112 and R23, respectively), had indicated the presence of yield-contributing QTL. In the present study, root system architecture (RSA) and root and shoot biomass of the same NIRLs were evaluated. The study was conducted by using two different micro-methods, i.e. paper no-roll (PNR) and rhizotrons (RHZ). The results obtained from both methods showed that presence of 7AgL portions significantly enhanced several root traits involved in yield performance and nutrient uptake in the three NIRLs compared to their controls lacking any 7AgL segment. In particular, presence of the 5% 7AgL segment differentiating the NIRL with 28% 7AgL from that with 23% 7AgL, determined a significant increase in most of the analysed traits, such as spread of root angle (+17% and +37% with PNR and RHZ, respectively), average root diameter (+14% and +34%), root biomass (+31% and +38%) and radical apparatus length. The results obtained allow to functionally dissect the 40% 7AgL spanning the alien content of the three NIRLs, and hence to associate the genetic control of several root traits to defined 7AgL portions. The same comparative analysis has been conducted on bread wheat-Thinopyrum ponticum lines, such as the T4 translocation line (7DS.7DL/7AgL; the 7AgL segment of this lines include the segments present in the 3 durum wheat NIRLs) and the KS24 line, characterized by another 7AgL accession of the Thinopyrum ponticum (called 7el2L). Proves conduced in bread wheat confirmed 7AgL alleles specificity to determinate the positive contribution for analysed RSA traits. Were conducted further investigations, with paper roll (PR) method, on the same recombination/translocation lines of durum and bread wheat relating to architecture and root biomass in water stress conditions. It was confirmed the positive contribution of 7AgL segments to RSA traits even under limited water conditions (particularly for biomass and root length related traits). A further aspect that the same materials above described have allowed to analyse concerned epigenetic alterations (particularly DNA methylation) potentially resulting from the introduction of alien genetic material in durum wheat genome. Little is known about epigenetic effects resulting from the transfer of small amounts of genetic material from wild relatives species, especially after several generations from the creation of such "partial hybrids". For the evaluation of these changes, have been used an immunoassay vs 5-mC and the MSAP (Methylation Sensitive Amplification Polymorphism) method in different tissues (leaves, anthers) and physiological stages (Z1.3, Z2. 2-Z2.3, I and II mitotic division of micro-gametogenesis) of durum wheat-Th. ponticum recombinant lines. In particular the MSAP method allowed, through the use of three different enzymes with different sensitivity to methylated cytosines (EcoRI; MspI, HpaII) and 8 pairs of selective primers, to carry out both a quantitative analysis and a sequence-specific analysis of methylation changes in the four development phases and also between recombinant (HOM +) and control lines (not carriers of 7AgL segments, HOM-). Both methods have shown in the HOM+ and HOM- NIRLs a conservation of the ~ 90% for methylation profiles, even though there was hyper-methylation associated with the presence of wild segments. Through the MSAP system have been analysed 574 "GGCC" sites, which showed a different methylation both in relation to tissue and development phase but also in relation to the 3 7AgL segments; associated to the presence / absence of the 7AgL were identified 173 methylation polymorphisms, 123 of which were attributable to the recombinant R23. This recombinant showed, qualitatively and quantitatively, the main methyl alterations compared to R5 and R112 NIRLs. The results showed that the effects in genome-wide DNA methylation levels in genotypes derived from interspecific transfer of limited size chromosomal segments are mainly limited, at least to the BC4-5F7 generation; It was however highlighted a proportionality between size of the transferred 7AgL segments and extent of changes in the methylation pattern and furthermore has been suggested the possible involvement of the gene Sd (Segregation distortion), present in the 12% 7AgL exclusive of R23, in the most marked epigenetic modifications observed in the NIRL R23 HOM+.