Valutazione dello stato di salute di Posidonia oceanica (L. Delile) del Tirreno settentrionale attraverso l’utilizzo di marcatori nucleari e funzionali

Abstract

La Posidonia oceanica è una fanerogama comune nel bacino del Mar Mediterraneo dove forma vaste praterie lungo le coste ricoprendo un ruolo ecologico fondamentale per la produzione di materiale organico e di ossigeno; è inoltre luogo di riparo e nursery per molte specie animali e vegetali e contribuisce al mantenimento dell’equilibrio dei litorali contenendo l’erosione costiera. L’utilizzo di Posidonia oceanica come indicatore biologico di inquinamento chimico risale agli anni ‘80. In effetti questa fanerogama presenta tutte le qualità richieste per un impiego in questo senso: specie bentonica, longeva, largamente diffusa in tutto il bacino del Mediterraneo e con capacità di bioaccumulo di contaminanti persistenti. Il lavoro presentato ha riguardato la standardizzazione di un sistema rapido e riproducibile di monitoraggio ambientale sulle acque costiere del Tirreno settentrionale utilizzando come bioindicatore la Posidonia Oceanica. Questo tipo di controllo si basa sul principio che una sostanza tossica può essere rilevata negli organismi viventi ad essa esposti tramite l’analisi di biomarcatori (markers molecolari), che comprendono l’insieme dei cambiamenti cellulari, molecolari e biochimici indotti da inquinanti chimici misurabili in tessuti, cellule e fluidi biologici. Le aree di studio sono quattro praterie antistanti il tratto costiero tirrenico settentrionale di Lazio e Toscana: SIC "Fondali antistanti Punta Murelle" IT6000002 (1.111,99 ha), SIC "Fondali tra il Chiarone e il Fiora" IT6000001 (1.761,9 ha),” Isola di Giannutri” IT51A0024 e SIC “ Secche di Tor Paterno” IT 6000010 (26,79 ha). Lo studio di biomarcatori correlati a specifici stress ambientali ha riguardato:  enzimi antiossidanti correlati allo stress ossidativo: Catalasi (CAT), Glutatione-S-transferasi (GST), Perossidasi (POX) e Superossidodismutasi (SOD) (Ranvier et al., 2000; Ferrat et al., 2002; Hamoutène et al., 2002; Bucalossi et al., 2006);  geni responsivi all’accumulo di metalli pesanti: Metallotioneina 2b (MT-2b); Cromometilasi (CMT);  geni responsivi alla disponibilità di luce: Geranilgeranil reduttasi (CHL P), Citocromo c Ossidasi (CcOx), Peptidasi Putativa (PeP), Ribulosio 1,6-Bisfosfato Carbossilasi/Ossigenasi (RuBisCO) (Bruno et al., 2010; Serra et al. 2012). Nell’ambito di questo lavoro sono state anche effettuate analisi della struttura genica delle praterie studiate attraverso analisi della variabilità genetica, utilizzando sette marcatori microsatelliti altamente polimorfici (Alberto et al., 2005). Dalle analisi della struttura genica è emerso come le cinque praterie siano essenzialmente un mosaico di un'unica prateria originaria dove Chiarone e Murelle sono sostanzialmente identiche mentre la prateria di Giannutri sembra essere molto più vicina a quelle di Tor Paterno. Differenze interessanti sono state riscontrate tra le due praterie di Tor Paterno a differenti profondità. Dai dati ottenuti dall’analisi dei metalli pesanti a livello fogliare, si rileva come i campioni prelevati dal sito di Giannutri presentino contaminazioni molto elevate di Pb e Cr, ma anche di Cu e Ni, questi ultimi secondi solo al sito di Tor Paterno. I campioni prelevati dai siti di Chiarone e Murelle presentano una minore contaminazione da metalli pesanti che hanno valori di concentrazione piuttosto simili, ad indicare una storia comune, fatta eccezione per il Cu che in Murelle presenta i valori più bassi di tutti i siti. Dai risultati ottenuti dall’analisi dell’espressione genica e dell’attività enzimatica dei biomarcatori, il sito di Murelle sembra quello più attivo nella risposta a stress di tipo ossidativo sia a livello di geni che di enzimi. I bassi livelli di Cu nel sito di Murelle suggeriscono l’ipotesi che un’eccessiva quantità di tale metallo possa avere effetto inibitorio sui biomarcatori considerati. Per gli altri metalli non è stato possibile legare la risposta del biomarcatore ad una condizione peculiare del singolo sito, in quanto la risposta della pianta può dipendere sia da una esposizione dose- e tempodipendente che dall’effetto sinergico di più metalli. Data anche l’importanza economica ed ecologia della P. oceanica, sarebbe auspicabile comprendere quale sia il reale livello di tolleranza della pianta rispetto a stress mirati e controllati attraverso l’allestimento di acquari di monitoraggio. Questo consentirebbe di confrontare le risposte che si hanno in mare rispetto a quelle ottenute in acquario, dove gli stress vengono applicati secondo trattamenti dose-tempo precisi, in esposizione singola o combinata. Per quanto riguarda i risultati dei biomarcatori responsivi alla disponibilità di luce, i dati estrapolati da questo lavoro ci spingono ad ipotizzare che la prateria più disturbata da un punto di vista luminoso sia quella di Murelle, anche se durante il campionamento non è stato possibile effettuare misure relative a PAR e Chl a, per cui la nostra è una valutazione per deduzione rispetto al comportamento di questi biomarcatori allo stress luminoso, secondo quanto già noto in bibliografia.

Posidonia oceanica (L. Delile), commonly known as the Neptune Grass, is a marine flowering seagrass endemic of the Mediterranean Sea; forming vast grasslands along the coast, it contributes to preserve costal environments from erosion. Furthermore, P. oceanica conveys important ecological services such as the consistent production of organic matter and oxygen and represents a shelter site and a nursery area for several species belonging to different groups (both in the Animalia and in the Plantae kingdom). The use of P. oceanica as a biological indicator of chemical pollution dates back to the 80s; this seagrass has indeed all the requirements for being successfully used as a biological indicator, i.e. it’s a long living benthic species, widely spread throughout the Mediterranean basin and has the capability of accumulate persistent pollutants. A standardized, fast and reproducible technique for coastal waters’ monitoring using Posidonia oceanica as bioindicator is proposed in this manuscript. This technique is based on the detection of molecular markers in P. oceanica (biomarkers) induced by the contamination of toxic substances; the exposure to pollutants, indeed, causes a whole range of cellular, molecular and biochemical changes in P. oceanica that can be precisely measured in tissues, cells and biological fluids. The study area included four meadows of the Tyrrhenian coastline of Northern Lazio and Tuscany: in particular, the SIC "Backdrops front Punta Murelle" IT6000002 (1,111.99 ha), the SIC "Backdrops between Chiarone and Fiora" IT6000001 (1761.9 ha), the SIC "Giannutri" IT51A0024 and, finally, the SIC "Tor Paterno" IT 6,000,010 (26.79 ha). Several biomarkers of specific environmental stressors have been identified in this study. In particular: • the antioxidant enzymes related to oxidative stress: catalase (CAT), glutathione-S-transferase (GST), peroxidase (POX) and superoxide dismutase (SOD) (Ranvier et al., 2000; Ferrat et al., 2002; Hamoutène et al., 2002; Bucalossi et al., 2006); • the genes responsive to heavy metal accumulation: 2b-metallothionein (MT-2b) and Chromomethylase (CMT); • the genes responsive to light availability: geranylgeranyl reductase (CHL P), Cytochrome c oxidase (CCOX), putative peptidase (PEP) and ribulose 1,6-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RuBisCO) (Brown et al., 2010; Serra et al. 2012). Furthermore, as part of this study, the analysis of the genetic variability of P. oceanica was assessed through genetic structures analysis based on seven highly polymorphic microsatellite markers (Alberto et al., 2005). The findings of this study suggest that P. oceanica populations inhabiting the four meadows in the Tyrrhenian coastline of Northern Lazio and Tuscany are essentially a mosaic of a single original prairie; P. oceanica inhabiting the Chiarone and the Murelle sites are substantially identical from a genetic perspective, while the one inhabiting the Giannutri site appeared to be genetically similar to those inhabiting the Tor Paterno site. An interesting finding of this study was the identification of genetic differences between P. oceanica inhabiting different depths within the Tor Paterno site. From the analysis of heavy metals accumulation at the leaf level, the site of Giannutri appeared to be characterized by an extremely high contamination of Pb and Cr and lower concentration of Cu and Ni, which, on the contrary, represented the principal contaminants of the Tor Paterno site. P. oceanica inhabiting the Chiarone and Murelle sites were characterized by lower levels of heavy metals contamination; contaminants concentration in these two sites appeared rather similar (with the exception of Cu, which at the Murelle site is present in the lowest concentration), suggesting a common history of this two sites. The analysis of biomarkers gene expression and enzymatic activity revealed that P. oceanica specimens inhabiting the Murelle site are more active in oxidative stress responses, both at the genetic and the enzymatic level. The low levels of Cu characterizing the Murelle site suggests that excessive amounts of this metal may have an inhibitory effect on the considered biomarkers. The relationship between biomarkers response and the peculiar conditions characterizing each site has not been addressed for the other heavy metals, considering that the plant response can depend on both a dose-time dependent exposure and the synergistic effect of more metals. Considering the economic and ecological importance of Posidonia oceanica, further studies are recommendable; in particular, the identification of the real levels of stress tolerance of the plant should be addressed in controlled situations, such as targeted and controlled aquariums monitoring. Comparing P. oceanica response in controlled situation with the one of wild population inhabiting different environments would indeed provide important insights on the overall process of stress response of this seagrass, allowing to discriminate between synergic and single effects, as well as short term and long term exposures. Finally, the analysis of biomarkers responsive to light exposure, and the comparison of the findings of this study with others reported in literature, suggests that P. oceanica inhabiting the Murelle sites is the one more affected from poor light condition.