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http://hdl.handle.net/2067/2854
Title: | DOWN – Regulation of the lamin A/C in neuronal cells correlates with immature phenotype | Other Titles: | La regolazione negativa della lamina A/C in cellule neuronali correlata a un fenotipo immaturo | Authors: | Nardella, Marta | Keywords: | Lamin A/C;Neuroblastoma;Tumor-initiating cells;MicroRNAs;Neuronal maturation;Cerebellar granule cells;Cellule inizianti il tumore;Maturazione neuronale;Granuli cerebellari;BIO/11 | Issue Date: | 8-May-2015 | Publisher: | Università degli studi della Tuscia - Viterbo | Series/Report no.: | Tesi di dottorato di ricerca. 27. ciclo | Abstract: | Nuclear lamins are type V intermediate-filament proteins that form a meshwork-like scaffold underlying the inner nuclear membrane providing mechanical support to the nucleus. It is now clear that lamins exert many different functions within the cell, most of them still largely unknown. Among lamins, the A-type ones (Lamin A/C) are expressed in differentiated tissues and are involved in differentiation processes during the embryonal development. Their expression is reduced or absent in several human malignancies, even though their role in the tumorigenesis has not been characterized yet. It is widely accepted that tumor progression is often associated with regression from a more differentiated to a less differentiated state, therefore loss of Lamin A/C expression is of particular interest. We previously demonstrated that Lamin A/C is necessary for the acquisition of a differentiated phenotype in neuroblastoma cells and its loss is associated to an increased cell aggressiveness. Neuroblastoma (NB) is a highly aggressive embryonic tumor originating from the autonomic nervous system and represents the most common extracranial solid cancer in childhood. Despite the identification of molecular markers, such as MYCN amplification, turned out to be greatly useful in terms of patients’ stratification and therapeutic protocols implementation, new molecular targets are required to clarify the heterogeneity and progression of this tumor. Thus, based on our previous results and considering that Lamin A/C expression uniquely in differentiated tissues, we intended to examine a possible role of Lamin A/C in the maturation of cells of neuronal origin. In particular, we reasoned that NB differentiation impairment in the absence of Lamin A/C was mainly due to the acquisition of a stem-like phenotype and a concurrent development of tumor-initiating cells with self-renewal features. In addition, considering the wellknown hallmark of NB MYCN, normally amplified in poorly differentiated tumors displaying immature characteristics, we intended to investigate whether an inverse relationship between LMNA and MYCN gene could exist in NB. In this study, we observed an inverse relationship between LMNA and MYCN expression levels in 23 biopsies of NB. Using two NB cellular models, expressing LMNA or MYCN alternatively, we demonstrated that this inverse correlation is due to changes of members of miRNA signatures controlling cell proliferation and differentiation. Moreover, we provide evidence that the down regulation of Lamin A/C expression in the SH-SY5Y NB cells allows the development of a tumor-initiating cells (TIC) population, a rare tumorigenic cell population known to be responsible for sustaining tumor growth, metastases and relapse, and usually named cancer stem cell population. Stem cell characteristics, such as sphere-forming, dye exclusion ability and an increased expression of the stem cell regulatory network (POU5f, which encodes Oct4, NANOG and SOX2) as well as of PROM-1, encoding for CD133, and ABCG2 were detected in our TIC population. IV Furthermore, TIC-derived tumors obtained after TIC cells implantation in nude mice showed a more malignant phenotype with respect to the parental cell line. The characterization of NB TICs may be a crucial step for the improvement of antitumoral therapies. In agreement with the aforementioned NB biopsies, the development of a TIC population in NB correlates with the increased expression of MYCN gene observed in these cells. Indeed, by upregulating MYCN, control cells acquired a stem-like phenotype; while down-regulating MYCN in the LMNA silenced cells, we were able to restore a more mature phenotype. Consistently with our data in the NB models, we also showed how Lamin A/C knock down in primary cells explanted from the cerebellum of neonatal rats prevents glutamate-mediated neuronal death which is a signal of the complete maturation of granule cells. This evidence strongly supports the idea that Lamin A/C expression is an exclusive characteristic of the cells that begin the maturation process and terminally differentiate. This thesis work provides new mechanistic insight into the development of a stem-like NB TIC population. Targeting of the TICs in a tumor represents a challenge for the reduction of the tumor mass and/or the incidence of tumor recurrences. Therefore, our data may provide opportunities to develop new personalized therapeutic strategies based on the molecular profile of the tumor. Le lamine nucleari sono proteine che appartengono alla classe dei filamenti intermedi di tipo V. Esse formano una struttura reticolare al di sotto della membrana nucleare interna e svolgono diverse funzioni, alcune delle quali non sono state ancora del tutto chiarite. Le lamine di tipo A sono espresse nei tessuti differenziati e sono coinvolte nei processi differenziativi che avvengono durante lo sviluppo embrionale. La loro espressione risulta ridotta o assente in molti tumori umani, tuttavia il loro ruolo nella tumorigenesi non è stato ancora caratterizzato. La perdita della Lamina A/C è di particolare interesse, poiché la progressione del tumore è spesso associata ad una regressione dello stato differenziativo delle cellule tumorali. Nel nostro laboratorio è stato precedentemente dimostrato che la Lamina A/C è necessaria per il differenziamento delle cellule di neuroblastoma e che la sua perdita è associata ad un aumento dell’aggressività tumorale. Il neuroblastoma (NB) è un tumore altamente aggressivo del sistema nervoso autonomo ed è il più comune tumore solido extracranico in età pediatrica. Nonostante l’identificazione di marker molecolari - come l’amplificazione del fattore di trascrizione MYCN - si sia rivelata molto utile dal punto di vista della stratificazione dei pazienti e della realizzazione di protocolli terapeutici, sono necessari nuovi target molecolari per rendere maggiormente chiara l’eterogeneità e la progressione del tumore. Sulla base dei dati precedentemente ottenuti e considerando che la Lamina A/C si esprime esclusivamente nei tessuti differenziati, l’obiettivo del lavoro è consistito nell’individuare il ruolo della Lamina A/C nei processi di maturazione delle cellule di origine neuronale. In particolare, è stato osservato che l’assenza della Lamina A/C predispone le cellule a un fenotipo staminale, favorendo così lo sviluppo di cellule capaci di iniziare il tumore con le caratteristiche di autorinnovamento. Inoltre, prendendo in considerazione il ben noto marcatore del NB, MYCN - normalmente amplificato nei tumori poco differenziati che mostrano caratteristiche immature - abbiamo esaminato la possibile esistenza di una relazione inversa tra LMNA e MYCN nel NB. In questo studio abbiamo osservato una relazione inversa tra i livelli di espressione di LMNA e MYCN in 23 biopsie di NB. Utilizzando due modelli cellulari di NB che esprimono o LMNA o MYCN abbiamo dimostrato come questa correlazione inversa sia da attribuire ad un’alterazione del profilo di espressione di microRNAs che controllano la proliferazione e il differenziamento cellulare. Inoltre, abbiamo dimostrato che il silenziamento della Lamina A/C nelle cellule di NB SH-SY5Y comporta lo sviluppo di una popolazione di cellule inizianti il tumore (TIC), ovvero una II piccola popolazione di cellule responsabili della crescita del tumore, delle metastasi e delle recidive, nota come popolazione di cellule staminali tumorali. Tali cellule hanno molte caratteristiche specifiche delle cellule staminali - come la capacità di formare sfere e di espellere coloranti - ed esprimono marcatori di cellule staminali: POU5f, che codifica Oct4, Nanog, SOX2, nonché PROM- 1, che codifica per CD133, e ABCG2. Inoltre, questa popolazione cellulare – diversamente da quella di origine – presenta un elevato potenziale tumorigenico in quanto le cellule sono in grado di generare un tumore quando inoculate in topi nudi. La caratterizzazione di NB TIC comporta un passo cruciale per il miglioramento delle terapie antitumorali. Inoltre, come osservato nelle biopsie di NB, lo sviluppo di una popolazione di TIC in linee di NB correla all’incremento dei livelli di espressione del gene MYCN, come osservato in queste cellule. Infatti, sovraesprimendo MYCN, le cellule di controllo SH-SY5Y acquisiscono un fenotipo con caratteristiche staminali; al contrario, regolando negativamente i livelli di espressione di MYCN nelle cellule SH-SY5Y silenziate per Lamina siamo stati in grado di ripristinare il fenotipo più maturo. Coerentemente con i nostri dati nei modelli di NB, il silenziamento della Lamina A/C nelle colture primarie di cervelletto di ratti neonati blocca la morte neuronale glutammato-mediata, che rappresenta un segnale della completa maturazione dei granuli cerebellari. Tale risultato rafforza l'ipotesi che l’espressione della Lamina A/C sia una caratteristica esclusiva delle cellule che iniziano il processo di maturazione e di quelle terminalmente differenziate. Questo lavoro di tesi fornisce un modello di sviluppo di una popolazione di TIC nel neuroblastoma. Strategie mirate a colpire la popolazione di cellule staminali all’interno del tumore rappresentano una sfida per la riduzione della massa tumorale e/o dell'incidenza di recidive. Questi studi potrebbero consentire lo sviluppo di protocolli terapeutici personalizzati sulla base del profilo molecolare del singolo tumore. |
Description: | Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellulare |
URI: | http://hdl.handle.net/2067/2854 |
Appears in Collections: | Archivio delle tesi di dottorato di ricerca |
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