Approccio TILLING per il miglioramento delle caratteristiche qualitative ed agronomiche del frumento duro

Abstract

Nel presente lavoro di dottorato è stata utilizzata una nuova piattaforma TILLING di frumento duro per la selezione di linee ad alto contenuto di amilosio e di linee caratterizzate da variabilità genetica nei loci GW2, putativamente coinvolti nell’aumento delle rese. In frumento, i geni SBEIIa sono stati associati a caratteristiche qualitative di interesse relative alle proprietà nutrizionali e tecnologiche delle farine. La perdita di funzione di tali geni produce un fenotipo caratterizzato da un drastico incremento del contenuto di amilosio. I frumenti high amylose presentano un aumento della percentuale di “amido resistente” e sono caratterizzati da una ridotta digeribilità. Tale caratteristica contribuisce alla diminuzione dell’indice glicemico degli alimenti e rappresenta una nuova opportunità nella gestione di diverse malattie legate a disturbi alimentari, molto diffuse nel mondo occidentale. L’aumento delle rese è uno dei maggiori obiettivi nei programmi di miglioramento genetico delle specie coltivate. In particolare per il frumento, data la grande importanza agronomica che riveste, un incremento della produttività sarebbe auspicabile. Le rese rappresentano un carattere molto complesso, controllato da numerosi geni e con una forte influenza ambientale. Recenti lavori hanno dimostrato che la soppressione o la sottoregolazione dei geni Grain Weight 2 (GW2) in riso, mais e frumento è responsabile dell’incremento della dimensione del seme e di conseguenza di un significativo aumento delle rese. Il gene GW2 codifica per una ubiquitina ligasi E3 di tipo RING implicata nella degradazione proteica attraverso la via del proteosoma 26S. La funzione di questo gene in frumento non è stata ancora pienamente compresa. L’analisi TILLING per i due geni omeologhi SBEIIa ha portato complessivamente all’identificazione di 45 mutanti. Per entrambi gli omeoalleli SBEIIa è stata identificata una mutazione knock-out. La linea doppio nulli SBEIIa-A-B-, ottenuta attraverso la combinazione delle due linee singolo nulli SBEIIa-A- e SBEIIa-B-, ha mostrato una ridotta espressione dei geni SBEIIa, un fenotipo caratterizzato da granuli di amido deformati e un contenuto di amilosio raddoppiato rispetto alla linea controllo. Inoltre, è stata identificata una linea mutante (SVEMS_1433) particolarmente interessante perché ha presentato in entrambi gli omeoalleli SBEIIa la stessa mutazione deleteria. Questa linea ha mostrato un fenotipo identico al genotipo doppio nulli, con granuli di amido deformati ed un contenuto di amilosio notevolmente aumentato, confermando che le mutazioni identificate hanno un effetto deleterio sulla funzionalità delle proteine SBEIIa. Queste linee saranno utilizzate in programmi di breeding allo scopo di produrre varietà commerciali di frumento duro caratterizzate da un alto contenuto di amilosio. Al fine di selezionare le mutazioni di interesse all’interno di popolazioni segreganti, è stato messo appunto un saggio di genotyping, utile per la Marker Assisted Selection, basato sull’utilizzo dell’analisi High Resolution Melting. Per quanto riguarda i geni GW2, sono state identificate in totale 29 nuove varianti alleliche. Per ciascun allele è stata identificata una linea che possiede una mutazione all’interno del dominio conservato RING. In particolare, per l’allele GW2-A è stata identificata una mutazione missenso che porta al cambiamento di una delle cisteine altamente conservate ed implicate nella formazione del motivo a dita di zinco, tipico del dominio RING. Inoltre, per l’allele GW2-B è stata identificata una mutazione in uno dei siti di splicing, risultata deleteria per la funzionalità della proteina. La caratterizzazione dei mutanti trovati per entrambi gli omeologhi GW2 permetterà potenzialmente di comprendere la funzione di questo gene in frumento e di creare nuove linee con caratteristiche agronomiche superiori. Oltre l’approccio TILLING, è stata ricercata variabilità genetica per i loci GW2 nella varietà di frumento tenero a seme grande Lankaodali. L’analisi delle regione del promotore del gene GW2-A ha portato all’identificazione di un polimorfismo di tipo In/Del che comprende la regione della TATA box ed il sito di inizio della trascrizione, putativamente responsabile di una minor espressione del gene GW2-A. Tale varietà è stata incrociata con la cultivar di frumento duro Svevo e la varietà di frumento tenero Rebelde. Al fine di discriminare per la presenza o assenza del polimorfismo è stato sviluppato un marcatore basato sulla PCR, utile in programmi di breeding. Per concludere, i risultati ottenuti hanno mostrato che la popolazione TILLING di frumento duro cultivar Svevo rappresenta una valida risorsa per generare nuova variabilità genetica da utilizzare in programmi futuri di miglioramento genetico.

In this PhD project, a new TILLING platform of durum wheat has been used for the production of lines characterized by a high amylose content and lines with novel genetic variation in the GW2 loci, putatively involved in yield increase. In wheat, the silencing of the SBEIIa genes was reported to produce a high amylose phenotype and consequent increase of starch fraction with reduced digestibility, termed “resistant-starch”. The starch digestibility is of great interest for the modulation of the glycemic index of food products and for the control of some important dietrelated diseases. The genetic improvement of grain yield in major cereals has traditionally been one of the most important contributions to an increased global food supply. Grain size is the major component of grain yield in wheat and it is a quantitative trait controlled by both major and minor genes. Different studies suggest the Grain Weight 2 (GW2) is a negative regulator of grain width and weight and it is a useful locus for improvement grain yield in staple crops. The GW2 gene encodes a RING type E3 ubiquitin ligase involved in the degradation on protein substrate through the ubiquitin-26S proteasome system. The function of this gene in wheat has not yet been fully understood. The TILLING analysis led to the identification of 45 mutants for the two homeologous SBEIIa genes. A knockout mutation was identified for both SBEIIa omeoalleles. The double null SBEIIa-A-B- mutant line, obtained by crossing the two single null SBEIIa-A- and SBEIIa-B- mutant lines, showed a reduced expression of both SBEIIa genes, an altered starch granule morphology and a double amylose content compared to the control line. Furthermore, the identified SVEMS_1433 mutant was of particular interest because it presented the same deleterious mutation in both SBEIIa homoeoalleles. This mutant showed the same phenotype to the double null SBEIIa-A-B- line, with aberrant starch granules and a greatly increased amylose content, confirming that the identified mutations have a deleterious effect on the functionality of SBEIIa proteins. The most interesting SBEIIa mutant lines, identified in the present work, will be used in breeding programs in order to produce commercial lines of durum wheat characterized by a high amylose content. To follow the mutations in segregating populations, a genotyping assay, based on the High Resolution Melting analysis and useful for the Marker Assisted Selection, was developed. Simultaneously, partial genomic sequences of both GW2 homoeoalleles (GW2-A and GW2-B) have been isolated for TILLING purposes. Screening analyses resulted in the identification of 39 new allelic variants for GW2 homoeologous genes. For each allele a line carrying a deleterious-predicted mutation in the conserved RING domain was identified. In particular, for GW2-A a missense mutation leading to a substitution of the highly conserved cysteine involved in the zinc finger motif formation, typical of the RING domain, has been identified. Furthermore, for the allele GW2-B, a knock-out mutation was also identified. The characterization of the GW2 identified mutants pave the way for understanding the function of this gene in wheat and for developing new lines with an increased yield. Interestingly, in addition to the TILLING approach, sequencing analyses of the GW2 gene promoter region of the natural variety Lankaodali, characterized by a higher grain size, showed a 114 bp deletion including the TATA box element and the Start Transcription Site (SST), in comparison to small seed genotypes. This variety was crossed with both the durum wheat cultivar Svevo and bread wheat cultivar Rebelde. In order to discriminate the presence or absence of the In/Del polymorphism, a PCR-Marker Assisted Selection assay useful in breeding programs, has been developed. So far, our results showed that the Svevo TILLING population used in this work represents a powerful reverse valid resource to generate novel genetic variability to be used in future breeding programs of durum wheat.