Biotechnological production of vanillin using microbial cells

Abstract

This PhD research project focused on the optimization of the biotechnological process for vanillin production from ferulic acid using recombinant Escherichia coli cells. Nowadays flavours market covers about one fourth of the global food additives market with a 25 million dollar turnover and a 5.5% growth rate. Flavouring compounds are generally produced by chemical synthesis or extractive methods from natural sources. Flavours produced by chemical synthesis, are classified as “artificial flavours”; also these processes are damaging for environment and cause some problems with unwanted compounds, with reduction of the process efficiency and rise of the product recovery costs. On the other hand, extraction processes from plants are often more expensive because of the low concentrations of the molecules target in the raw material. Moreover cost of aromatic compounds extracted from plants depends on uncontrollable factors such as plant diseases and weather conditions. The drawbacks of both methods and the increasing interest of consumers in natural product (Sinha et al., 2008), reported in recent market surveys, have led a great interest in the exploration of more “eco-friendly” procedures for production of natural flavours. Vanillin is the major compound responsible for vanilla aroma. It is one of the most commonly used aromatic compounds in drugs and food industry. Since vanillin extracted from cured vanilla beans is very expensive and its availability depends on plantations production, curing process duration and labour costs. Synthetically produced vanillin is the most commonly used in vanilla flavoured products, and covering 99% of the global market. According to the regulation No 1334/2008 of the European Parliament and of the Council, vanillin produced by biotechnology from natural feedstocks can be classified as ‘natural flavoring’, provided that the source is always specified. All these factors make vanillin an important commercial target for biotechnological industry, and bases and applied research. Since vanillin is an intermediate product of the ferulic acid catabolism (a compound present in significant quantities in the lignocellulosic material) it is possible to confer the ability to convert ferulic acid to vanillin, through metabolic engineering, to strains unable to degrade ferulic acid. Unfortunately these bioconversion processes are not economically competitive yet; the high chemical activity and toxicity of both the product (vanillin) and the substrate (ferulic acid) cause low yield in the bioconversion process. With this research project, aiming at develop a competitive bioconversion process for vanillin production, many factors influencing the system productivity and selectivity, have been optimized. Bioconversion experiments carried out using resting cells of E. coli demonstrated that composition and pH of bioconversion buffer affected the formation of vanillin and unwanted products such as vanillyl alcohol. Using moderately alkaline bioconversion buffer (pH 9.0) it has been possible to double the amount of final product, with respect to the systems until now described. Using the statistical approach of the Response Surface Methodology (RSM) it has been possible to evaluate the synergic effect of ferulic acid concentration and stirring speed on the productivity and selectivity of the bioconversion process. Our results demonstrated that the highest vanillin title obtained incubating cells at 135-165 rpm range and initial ferulic acid concentration of 12-18 mM. Under optimized working conditions, vanillin yield increased from 8.51 ± 0.02 to 11.63 ± 0.1 mM, while, ferulic acid concentration higher than 20 mM cause a drastic decrease in vanillin production. Finally, to maintain low initial concentration of ferulic acid in the bioconversion buffer a two-phase (solid-liquid) system for the controlled release of the substrate has been developed. Using agarose gel cylinders containing ferulic acid, in conjunction with optimized buffer and nutrient amendments (LB medium), we demonstrated that, compared to previous results (Barghini et al., 2007), it is possible to increase vanillin final title (up 20%); to reduce the bioconversion time from 4 to 1 day; to increase the final vanillin concentration in the liquid phase of 5-fold. The maximum amount of accumulated vanillin in the liquid phase under optimized conditions was 20.57 ± 0.05 mM, the highest found in the literature for recombinant E. coli strains. In conclusion, results obtained demonstrated that vanillin production by resting cells of E. coli can be increased significantly by acting on several parameters, including the bioconversion buffer formulation and the way to modulate the substrate concentration.

Questo progetto di tesi ha riguardato lo studio e l’ottimizzazione della produzione biotecnologica di vanillina a partire da acido ferulico utilizzando ceppi ricombinanti di Escherichia coli. Attualmente, il mercato degli aromi copre circa un quarto del mercato mondiale degli additivi alimentari, e il suo giro d’affari è stimato in 25 milioni di dollari, con un tasso di crescita annuo del 5.5%. I composti aromatici vengono generalmente prodotti per sintesi chimica o per via estrattiva da matrici naturali. Le sostanze aromatizzanti ottenute per sintesi chimica, anche se a partire da materie prime naturali, sono classificate come “aromi artificiali”; inoltre questo tipo di processi possono essere dannosi per l’ambiente e comportare alcuni problemi come la formazione di composti non desiderati, con conseguente riduzione nell’efficienza del processo e aumento dei costi di recupero del prodotto. D’altra parte i processi di estrazione da matrici naturali sono spesso costosi a causa della bassa concentrazione delle molecole di interesse. In questo caso i maggiori svantaggi sono legati al fattori ambientali e climatici che comportano un prezzo di mercato molto alto. Gli svantaggi dei metodi estrattivi e di sintesi, e l’interesse crescente dei consumatori per prodotti naturali (Sinha et al. 2008), ha portato alla ricerca di strategie ecosostenibili per la produzione di aromi naturali, come la vanillina. La vanillina è il composto caratterizzante dell’aroma di vaniglia, e rappresenta una delle principali sostanze aromatizzanti impiegate nell’industria alimentare e farmaceutica. La vanillina estratta dai baccelli curati dell’orchidea Vanilla planifolia è molto costosa, poiché la sua produzione è limitata dall’areale di diffusione della pianta, da fattori climatici e ambientali che condizionano lo sviluppo della pianta, dall’impollinazione che deve essere effettuata manualmente e dalla durata del processo di cura dei baccelli di vaniglia. Nei prodotti aromatizzati alla vaniglia si utilizza quasi esclusivamente vanillina ottenuta per sintetica chimica, che di fatto ricopre circa il 99% del mercato mondiale. In accordo con il Regolamento Europeo 1334/2008 del Parlamento e del Consiglio, la vanillina prodotta per via biotecnologica a partire da materie prime naturali è classificabile come aroma naturale a condizione che la matrice di partenza venga sempre specificata. Questi fattori rendono la vanillina un target commerciale importante per le industrie biotecnologiche, e per la ricerca di base e applicata. Poiché la vanillina è un intermedio del catabolismo dell’acido ferulico (composto presente in abbondanza negli scarti lignocellulosici), ed i geni che codificano per gli enzimi responsabili della degradazione dell’acido ferulico sono stati caratterizzati, è possibile conferire la capacità di convertire l’acido ferulico in vanillina, tramite tecniche di ingegneria metabolica, anche a ceppi che non sono in grado di degradare questo composto. Purtroppo i processi per la produzione biotecnologica di vanillina non sono ancora competitivi dal punto di vista economico; l’elevata reattività della vanillina e la tossicità sia del prodotto che del substrato (acido ferulico) comportano basse rese e alti costi nel recupero del prodotto, nonché un alto impatto ambientale a una selettività poco elevata, il che può portare alla formazione di prodotti indesiderati la cui presenza può essere incompatibile con l’uso alimentare. In questo lavoro di tesi è stata valutata la possibilità di utilizzare cellule resting di E. coli per produrre vanillina a partire da acido ferulico, andando a valutare parametri importanti che influenzano la produttività e la selettività del sistema catalitico. I risultati ottenuti hanno evidenziato che l’efficacia del processo di bioconversione è strettamente collegata alla formulazione e al pH del mezzo di bioconversione. Utilizzando tamponi di bioconversione moderatamente alcalini (pH 9.0) è possibile ottenere un incremento di due volte nella quantità di prodotto finale rispetto ai sistemi fino ad oggi descritti. Inoltre, utilizzando l’approccio statistico della Superficie di Risposta (Response Surfece Methodology, RSM) è stato possibile valutare l’effetto sinergico della concentrazione iniziale di acido ferulico e della velocità di agitazione sulla resa molare e la selettività del sistema catalitico. Tali prove hanno dimostrato che entrambe le variabili influenzano il processo e che i risultati migliori sono ottenuti fissando la velocità di agitazione tra 135-165 rpm e la concentrazione di acido ferulico tra 12-18 mM. Nelle condizioni ottimali individuate nel presente lavoro la vanillina prodotta con cellule resting di E. coli FR13 è aumentata da 8.51 ± 0.02 a 11.63 ± 0.1 mM. Concentrazioni iniziali di acido ferulico superiori a 20 mM causano un drastico decremento nella quantità massima di vanillina. Infine, per controllare la concentrazione di acido ferulico nel mezzo di bioconversione è stato sviluppato un sistema a due fasi (solido-liquido) per il rilascio controllato del substrato nel mezzo di bioconversione. Utilizzando acido ferulico intrappolato all’interno di cilindri di agarosio è stato possibile, rispetto a quanto ottenuto in studi precedenti (Barghini et al., 2007), incrementare la quantità massima di vanillina prodotta del 20%; ridurre la durata del processo da 4 ad un giorno; aumentare la concentrazione di vanillina nel mezzo liquido di cinque volte, fino a 20.57 mM , la quantità più alta attualmente ottenuta in letteratura sfruttando cellule resting di E. coli. In conclusione i dati mostrati indicano che la produzione di vanillina mediante cellule resting di E. coli può essere incrementata in modo significativo agendo su più parametri di processo, inclusi la formulazione del mezzo di bioconversione e la modalità di somministrazione del substrato.