Studio della divergenza dovuta a selezione di popolazioni animali allevate attraverso analisi funzionale con microarray

Abstract

Nel corso degli ultimi anni, lo studio del profilo di espressione genica è diventato un elemento cruciale della ricerca diretta a chiarire la funzione dei geni ed il comportamento cellulare. Il profilo di espressione può essere misurato a livello proteico oppure a livello di mRNA. In questo secondo caso, il presupposto teorico fondamentale su cui si basa lo studio delle funzioni cellulari è che la quantità di una particolare specie di mRNA sia correlata con quella della proteina per cui codifica, quindi qualsiasi cambiamento del profilo di espressione determinerà delle variazioni nella funzionalità o nel comportamento cellulare. Anche se certamente esiste un rapporto effettivo fra profilo di espressione e fenotipo, ne va comunque sottolineata l’elevata complessità. Fra le tecnologie attualmente a disposizione per la determinazione quantitativa dei profili di espressione genica, la tecnologia microarray sembra rappresentare l’approccio più diretto ed esauriente. La suddetta tecnica è stata utilizzata per studiare la divergenza dovuta a selezione di popolazioni animali allevate: nello specifico sono state confrontate due razze suine, la Casertana e la Large White, e due razze ovine, la Sarda e la Gentile di Puglia, che presentano attitudini produttive e caratteristiche fenotipiche ben diverse. Per quanto riguarda le due razze suine sono stati identificati geni responsabili dell’incremento dei depositi di grasso (up-regolati nella Casertana) e della tenerezza della carne (up-regolati nella Large White). Inoltre l’analisi dei pathway ha evidenziato che la maggioranza dei geni differenzialmente espressi erano coinvolti nel pathway del metabolismo dei carboidrati; tale esito è probabilmente dovuto al tipo di vita che conducono i suini di razza Casertana, in un ambiente semi-selvatico, e quindi con richieste di energia più alte, rispetto alla vita sedentaria che conducono i suini di razza Large White. Un altro pathway interessante, nel quale sono risultati coinvolti un buon numero di geni differenzialmente espressi, è quello della regolazione del sistema endocrino; questo risultato è probabilmente dovuto al tipo molto diverso di crescita che hanno le due razze suine. Il primo passo compiuto per analizzare invece le due razze ovine è stato quello di progettare un vetrino specie-specifico, vista l’assenza di valide proposte in commercio. E’ stato quindi elaborato Aristaeus , il primo vetrino per l’Ovis aries, a partire dalle EST depositate presso i database dell’NCBI, disegnando poi gli oligonucleotidi da spottare sul vetrino secondo i due criteri di Kane. Il chip, prodotto con la tecnologia CustomArray 90K Combimatrix, contiene 21743 oligonucleotidi univoci, in quadruplice copia, che identificano 10190 geni, circa il 50% dell’intero genoma della pecora. A questo punto sono state confrontate le due razze ovine con attitudini diverse, la Gentile di Puglia (lana/carne) e la Sarda (latte), al fine di: 1) valutare l’efficienza del chip, dalla coerenza del segnale prodotto in diversi esperimenti, all’affidabilità dell’uso delle due cianine (tutti hanno dato esito positivo); 2) utilizzare il chip per analizzare le differenze di espressione in geni potenzialmente coinvolti nel controllo della produzione di latte. Al fine di testare il vetrino sono stati condotti degli esperimenti utilizzando campioni di fegato delle due razze nelle stesse condizioni di sesso, età e stadio di lattazione (44 giorni dopo il parto). Successivamente è stato condotto l’esperimento a due differenti stadi di lattazione (stadio1, 6 giorni dopo il parto, stadio2, 44 giorni dopo il parto) sul tessuto mammario, sui cui vetrini sono comunque stati ripetuti gli stessi test di qualità. Per quanto riguarda gli esperimenti condotti sul fegato, sono risultati differenzialmente espressi alcuni geni coinvolti nell’ossidazione degli acidi grassi, come ad esempio PEX5, ATP5C1 e NDUFS1. Gli acidi grassi sono una delle maggiori fonti di energia del corpo, umano e animale, e sono conservati principalmente nei tessuti adiposi come i trigliceridi (TAG). Durante i periodi in cui c’è molta richiesta di energia, come ad esempio durante la lattazione, il livello degli acidi grassi non esterificati (NEFA) che circolano nel sangue aumenta ed i TAG si possono accumulare nel fegato portando a conseguenti patologie. Così la sovra espressione dell’ATP5C1 nel fegato della Sarda può essere interpretato come una auto protezione contro il potenziale pericoloso accumulo di TAG nel fegato. Sono inoltre state condotte delle QRT-PCR su 6 geni differenzialmente espressi nel fegato, al fine di confermare i risultati ottenuti con gli esperimenti con i microarray, e per tutti e 6 è stato ottenuto esito positivo. Per quanto riguarda gli esperimenti sulla espressione genica nella ghiandola mammaria, vari geni sono risultati differenzialmente espressi, tra le due razze e tra i due stadi di lattazione. Per lo stadio1, sono risultate up-regolate nella Sarda diverse caseine, la αS2, la β e la K. Sono inoltre state osservate variazioni significative nei geni coinvolti nella creazione delle matrici extracellulari e nell’adesione cellulare (TJP1 up-regolato nella Gentile, CDH5 and TNXB up-regolati nella Sarda), processi a loro volta fondamentali per la proliferazione cellulare, la morfologia della mammella, e la secrezione del latte. Allo stadio2, sono risultati ancora differenzialmente espressi i geni che codificano per la K caseina, e ad essi si sono aggiunti dei geni che sono coinvolti nella attività di ossido reduttasi (TGOLN2 e FTH1) e che producono le ECM (COL1A2) (up-regolati nella Sarda). Inoltre, ancora nella Sarda, sono risultati sovra espressi alcuni geni, come DAGLB, coinvolti nella lipolisi, particolarmente importante per la produzione di formaggio di pecora. Attraverso gli esperimenti di microarray descritti in questa tesi è stato quindi possibile individuare differenze di espressione genica tra le razze suine ed ovine analizzate, differenti per attitudini produttive ed impiego, dovute alla selezione.

In the recent years, the study of the gene expression profile has become a crucial element in the analysis of the genes function and cellular behaviour research. Gene expression profiles can be measured in terms of both protein and mRNA levels. In the latter case, it is known that a mRNA specific quantity is correlated with the protein production level. So, every change in gene expression level will modify both cellular behaviour and functionality. Although a relationship between expression profile and phenotype certainly exists, it is important to stress its elevated complexity. Amongst the technologies for the genetic profile quantity determination presently available, microarray technology represents the most direct and complete approach. This technique has been used in order to analyse genetic divergence of livestock due to selection. Two swine breeds, the “Casertana” and the Large White, and two ovine breeds, the “Sarda” and the “Gentile di Puglia”, were studied. In each species, the selected breeds underwent selection for different productive attitudes and different phenotypic characteristics. Concerning the two swine breeds, it was possible to identify genes responsible for fat deposition (up-regulated in the Casertana) and for meat tenderness (up-regulated in the Large White). Moreover, pathway analysis showed that most of the differentially expressed genes took part to the carbohydrate metabolism. This result could be addressed to the particular lifestyle of the Casertana, which lives in a semi-wild environment, with higher energy needs than the sedentary Large White. A good number of differentially expressed genes participate in another interesting pathway, the endocrine system regulation. This result is probably affected by the different growth rate of the two swine breeds. In order to analyse the two sheep breeds, it was necessary to design and produce a specific chip for the ovine species, since no valid products are currently available in the market. Therefore we decided to design a high-density in situ synthesized microarray, named Aristaeus, specific for Ovis aries. It was developed starting from ESTs deposited at the NCBI, then selecting the oligonucleotides to be synthesized on the chip according to the Kane’s criteria. The microarray was produced with CustomArray 90K Combimatrix technology and contains 21743 unambiguous oligonucleotides in four copies. The oligonucleotides correspond to 10190 genes, covering about 50% of whole sheep genome. At this point, the two ovine breeds with different attitudes (Gentile di Puglia: wool-meat; Sarda: milk) were compared, in order to: 1) evaluate chip efficiency; 2) analyse expression differences of genes potentially involved in milk production. To evaluate chip efficiency, experiments were carried out using liver samples from individuals of the two breeds farmed in the same conditions and of same sex and age, and lactation stage (44 days after lambing). All quality control tests for the Aristaeus chip demonstrated high reproducibility of the data. For these experiments, a cluster of differentially expressed genes resulted involved in the fatty acids oxidation, such as the peroxisomal targeting signal 1 receptor (PEX5), ATP5C1, and NDUFS1. Fatty acids are the major source of energy for body and are stored principally in the adipose tissue as triacylglycerols (TAG). However, during periods of negative energy balance, as may occur during lactation, the levels of unesterified fatty acid (NEFA) circulating in the blood are elevated and TAG can accumulate in the liver with possible pathological consequences. Thus the overexpression of the ATP5C1 gene in the liver of lactating Sarda individuals, may well represent a defence adaptation against the potentially harmful accumulation of TAG. To validate microarray data we tested with Quantitative Real Time PCR six genes. The differences in gene expression between the two breeds observed by QRT-PCR confirmed microarrays data. Afterwards, experiments aimed at the analysis of genes involved in the lactation process were performed on mammary gland tissue at two different lactation stages (stage 1: 6 days after lambing; stage 2: 44 days after lambing). The same quality checks were repeated for the second set of experiments, and also in this case all quality control tests demonstrated high reliability. Several genes resulted differentially expressed at each lactation stage. In particular, caseins αS2, β and K were among the upregulated genes in Sarda vs Gentile at lactation stage 1. Moreover, a significant difference between the two breeds was observed in the expression of genes involved in extracellular matrix formation and cell adhesion (TJP1 upregulated in Gentile, CDH5 and TNXB upregulated in Sarda). These two processes, according with the current literature, support cells in proliferation, accurate morphological organization, as well as in milk secretion. At stage 2, some interesting genes as those encoding casein K, and involved in oxidoreductase activity (like TGOLN2 and FTH1) and in ECM-interaction (like COL1A2), resulted overexpressed in Sarda. Finally, in Sarda, an overexpression of genes implicated in lipolysis, like lipase (DAGLB) was observed. Several studies have demonstrated that the lipolysis is particularly important in sheep cheeses making. Through the experiments described in this thesis, we demonstrated the usefulness of microarrays for the identification of differences in gene expression associated with different production attitudes in livestock.