Processing and accumulation of low molecular Weight glutenin subunits in wheat endosperm

Abstract

Among the various classes of LMW-GS, the most abundant are LMW-m and LMW-s, so called according to the first amino acid of mature sequence (Met and Ser respectively). We have hypothesized that the presence of the Asn residue in position 23 of LMW-s types determines a different maturation process, that might generate the cleavage of the peptide MEN by an Asparaginyl endoprotease. For this reason, the coding genes for these two protein types were mutated in position 23 in order to have Thr instead of Asn and viceversa. The mutated gene versions have been used to transform plants of durum wheat. The wild-type LMW-m type was used as control. Our hypotheses was confirmed in both cases. In regard to the mutated LMW-m type, MS analysis and Nterminal sequencing demonstrated that the mature peptide began with SCISGLERP-, like LMW-s type. Similarly, for the mutated LMW-s type, the N-terminal mature polypeptide was METSHIP, as for LMW-m type. Moreover, we set up a strategy that allows to study trafficking of LMW-GS and of other wheat storage proteins.No clear conclusion at this regard has in fact been reached yet. To work out this problem, constructs containing markers for cellular compartments (Vacuole, Golgi and ER) were used to transform wheat plants in order to monitor their intra-cellular trafficking, to backcross with other transgenic plants transformed with LMW-GS containing different tags, in order to eventually establish the precise route of deposition.

Tra le varie classi di LMW-GS, le più abbondanti sono le LMW-m e LMW-s, così chiamate in base al primo aminoacido della sequenza matura (Met e Ser, rispettivamente). E’ stato ipotizzato quindi che la presenza del residuo Asn in posizione 23 nelle LMW-s possa determinare una diversa maturazione, che potrebbe generare il taglio del peptide MEN da parte di un’asparaginil-endoproteasi. Per questo motivo, i geni codificanti per queste due proteine sono stati mutati in posizione 23 in modo da avere una Thr invece di un’Asn e viceversa. Le versioni del gene mutato sono state utilizzate per trasformare piante di frumento duro. La LMW-m wildtype( è stata utilizzata come controllo. La nostra ipotesi è stata confermata in entrambi i casi. Infatti, analisi MS e sequenziamento N-terminale hanno mostrato che la LMW-m mutata comincia con SCISGLERP-, così come la LMW-s type con METSHIP, come atteso. Inoltre, è stata messa a punto una strategia allo scopo di determinare il processo di smistamento delle LMWGS e delle altre proteine di riserva, sul quale non esistono ancora dati certi. Allo scopo, abbiamo prodotto dei costrutti contenenti marcatori per i compartimenti cellulari (Vacuolo, Golgi e ER), che sono poi stati usati per trasformare piante di frumento, in modo da poter monitorare il processo di smistamento. In seguito, tali piante verranno incrociate con altre piante transgeniche trasformate con LMW-GS contenenti diversi tags, allo scopo si definire la precisa via di deposizione.