Metodi elettroforetici bidimensionali applicati allo studio di diversi sistemi membranali

Abstract

Il progredire delle metodiche scientifiche e delle tecnologie nelle ultime decadi, ha catalizzato un’estensione degli scopi connessi agli studi in campo biologico spostando l’attenzione dalle riduttive analisi biochimiche a carico delle singole proteine ad un esame attento ed approfondito esteso all’intero proteoma. La proteomica nasce come naturale evoluzione della chimica delle proteine che rappresentava uno dei capisaldi nello studio della biologia durante gli anni ottanta. L’analisi proteomica implica la necessità di separare le proteine prima della loro caratterizzazione. Così tutta la qualità dell’intera analisi molto dipende dalle performance dei metodi di separazione adottati. Questa lavoro di tesi nasce dal condensamento di diverse pubblicazioni e vuole proporsi come un saggio delle diverse metodiche di elettroforesi bidimensionale applicabili allo studio di proteine di membrana. Utilizzando differenti tecniche elettroforetiche bidimensionali e di rivelazione sono state affrontate due tematiche di ricerca diverse su differenti sistemi biologici: nel capitolo 2 con una proteomica differenziale di tipo “classico” (2D IEF-SDS-PAGE) è stata studiata le degradazione delle proteine della membrana eritrocitaria durante la conservazione del sangue ad uso trasfusionale, nel capitolo 3 invece, prendendo come modello le proteine delle membrane fotosintetiche tilacoidali, è stato proposto un nuovo sistema elettroforetico bidimensionale nativo, sia in prima che in seconda dimensione (2D N-LP-IEF-SDS-PAGE), accoppiabile con una terza dimensione denaturante.

Developments in methods and technologies have resulted in an expansion of the purpose of biological studies from the reductionist biochemical analysis of single proteins to proteome-wide measurements. Proteomics and other complementary analysis methods are essential components of the emerging 'systems biology'. Proteome analysis implies the ability to separate proteins as a first step prior the characterization. Thus, the overall performance of the analysis strongly depends on the performance of the separation tool, usually two dimensional electrophoresis. This thesis gives an introduction to the proteomic technique and shows how twodimensional electrophoresis works with membrane proteins. Different subjects and biological systems were investigated using different separative two-dimensional electrophoresis techniques. In chapter one, two-dimensional gel electrophoresis (2D IEF-SDS-PAGE) and mass spectrometry were used to identify protein profile changes in red blood cell membranes stored over time under atmospheric oxygen, in the presence or absence of protease inhibitors. In chapter two, a new 3D native electrophoretic protocol is proposed for an exhaustive separation and identification of membrane proteins. This method is based on native liquid phase isoelectrofocusing (N-LP-IEF) of protein complexes in the first dimension, followed by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) in the second dimension, where both the pI and the molecular masses of protein complexes (2D N-LP-IEF-BN) were used to separate them in their native form.