Chimeric oil bodies as an alternative delivery system for peptide vaccines

Abstract

Transgenic plants have potential advantages over conventional expression systems for the production of recombinant antigens for the formulation of subunit vaccines. In particular, seed-targeted expression is attractive as proteins can stably accumulate. However, the purification of recombinant proteins from seeds may be difficult due to the complex spectrum of proteins present in this plant organ. The oleosin fusion technology represents an efficient method to simplify the purification of recombinant proteins from seeds. Oleosins are hydrophobic plant proteins embedded in small, oily organelles extremely abundant in oil storing seeds. These organelles, termed oil bodies, are easily isolated from other cellular components by flotation-centrifugation. Hence, exploiting the targeting of foreign proteins to oil bodies through oleosin-fusion is an efficient means to enhance accumulation and purification efficiency from seeds. So far, several pharmaceuticals have been produced and efficiently purified from plants through this technology. In this work a further application for oil bodies has been envisaged. In particular, owing to the corpusculate nature and lipid components, oil bodies have been considered as possible carriers of immunologically-active peptides (epitopes) for novel vaccine formulations. For this purpose, Arabidopsis thaliana plants have been engineered to express sequences derived from Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1) and influenza virus as fusions to 19K sunflower oleosin. Transgenic plants have been genetically characterized and oil bodies purified from transgenic seeds. Both wild type and chimeric oil bodies have been analysed by Mass Spectrometry approach either to reveal the whole composition of oil body associated proteins with the aim to fine characterize the vaccine carrier and to confirm the presence of the HIV-1- and influenza virus-derived epitopes in sunflower oleosin fusions. The immunological properties of the chimeric oil bodies have been evaluated in vivo by appropriate murine model. The ability to elicit cellular immune responses, that is crucial to protect against viral pathogens such as HIV-1 and influenza, has been demonstrated. Despite adjuvant properties has not been evidenced so far, preliminary results suggest that further investigation is necessary. In conclusion, the oil body-derived platform suggested in the present PhD thesis demonstrates the full applicability of this technology for plant-derived vaccines.

L’ampliamento delle conoscenze nel campo della biologia e della genetica molecolare e l’applicazione delle tecniche del DNA ricombinante in campo vegetale hanno consentito di individuare nelle piante un valido sistema per la produzione di molecole di interesse farmaceutico in alternativa ai sistemi di produzione più tradizionali. Tuttavia, la purificazione di molecole ricombinanti dai tessuti vegetali è spesso laboriosa, con rese finali non soddisfacenti. Nuove strategie mirate ad implementare la produttività delle piante “bio-fabbrica” e a semplificare le procedure di purificazione hanno indicato nel seme come organo ideale per l’accumulo di proteine ricombinanti ad elevati livelli. In particolare, la presenza all’interno del seme di speciali organelli, gli oleosomi che, grazie alle loro proprietà chimico-fisiche, possono essere facilmente purificati, ha favorito lo sviluppo di una tecnologia di purificazione innovativa. Questa prevede l’ancoraggio delle molecole ricombinanti a tali organelli mediante la fusione alle oleosine, la componente proteica più abbondante degli oleosomi. La strategia di fusione di sequenze eterologhe alle oleosine è stata impiegata con successo per purificare dai semi molecole ricombinanti di interesse farmaceutico prodotte in pianta. Nel presente lavoro è stata valutata la possibilità di utilizzare gli oleosomi non solo come sistema per la purificazione di proteine ricombinanti, ma anche come veicolo di antigeni in formulazioni vaccinali. A tale scopo piante di Arabidopsis thaliana sono state modificate geneticamente affinché esprimessero in associazione agli oleosomi sequenze antigeniche derivate da proteine del virus dell’immunodeficienza umana di tipo 1 (Human Immunodeficiency Virus type 1, HIV-1) e del virus dell’influenza come fusione con la sequenza di una oleosina di girasole. Le piante transgeniche esprimenti le oleosine chimeriche sono state caratterizzate geneticamente e gli oleosomi sono stati estratti dai loro semi. Gli oleosomi derivati sia da piante selvatiche che transgeniche sono stati caratterizzati nella loro componente proteica mediante spettrometria di massa, sia al fine di approfondire le conoscenze circa le caratteristiche molecolari di questo organello che per verificare la presenza delle sequenze antigeniche fuse alla sequenza dell’oleosina di girasole. Le proprietà immunologiche degli oleosomi chimerici sono state infine valutate mediante esperimenti di immunizzazione dimostrando la capacità di tali organelli di stimolare l’attivazione di risposte di tipo cellulo-mediato. Sebbene in questi esperimenti preliminari gli oleosomi chimerici non abbiano mostrato proprietà adiuvanti, ulteriori indagini devono essere compiute in questo senso. In conclusione l’impiego degli oleosomi proposto nella presente tesi di dottorato evidenzia le potenzialità della tecnologia per applicazioni in campo vaccinologico utilizzando le piante come “biofabbrica” per la produzione di molecole di interesse biofarmaceutico.