Basi molecolari e biochimiche del carattere sofficità nella cariosside del genere Avena

Abstract

Tra i cereali a paglia, Avena sativa (specie esaploide con genoma AACCDD), è caratterizzata da cariossidi estremamente soffici con indici medi di SKCS intorno a – 20, molto più bassi di quelli misurati nei frumenti teneri (14-90), segale ed orzo (40-60) e in grano monococco (-5 - 0). Questa elevata sofficità comporta alcuni aspetti negativi dal punto di vista agronomico e tecnologico. L’analisi delle basi genetiche e biochimiche di questa particolare tessitura della cariosside di avena sono state l’argomento di questo progetto di dottorato. La tessitura delle cariossidi in grano è controllata principalmente dalle puroindoline Pin-A e Pin-B, proteine espresse solo nell’endosperma e associate ai granuli d’amido. L’osservazione che A. sativa contiene geni simili a quelli che in grano tenero codificano per le puroindoline, ha lasciato supporre che le proteine (avenoindoline) codificate da questi geni possano avere un ruolo nel determinare la tessitura della cariosside di avena. Al fine di caratterizzare le proteine associate ai granuli d’amido in questa specie, proteine mai descritte precedentemente, sono stati analizzati genotipi esaploidi, tetraploidi e diploidi di Avena mediante tecniche elettroforetiche mono e bidimensionali, sequenziamento proteico e tecniche immunochimiche (Western blotting) utilizzando anticorpi policlonali specifici per le proteine in analisi. Inoltre sono state utilizzate tecniche di amplificazione PCR, RT-PCR e RACE e sequenziamento genico per identificare e caratterizzare i geni coinvolti. Dall’attività di ricerca è risultato che l’avena è l’unico cereale a cariosside soffice in cui le puroindoline (avenoindoline) non sembrano svolgere un ruolo nella modulazione del grado di durezza della cariosside. Questo ruolo sembra essere svolto invece da altre proteine, che abbiamo denominato vromindoline (vromi è il nome greco dell’avena), caratteristiche di questa specie ed assenti in grano. Le vromindoline (Vin) per sequenza, numero e posizione dei dieci residui di cisteina, punto isoelettrico basico, peso molecolare (13-14 KDa) e capacità di accumularsi sui granuli d’amido, sono molto simili alle puroindoline e appartengono anch’esse alla famiglia 2S. Tuttavia esse mostrano alcune caratteristiche peculiari, tra cui un dominio centrale con quattro residui di triptofano (invece di cinque o tre tipici di Pin-A e Pin-B, rispettivamente), la presenza di aminoacidi carichi alle due estremità della proteina matura e l’insolubilità in Cloroformio/Metanolo. Sui granuli d’amido di Avena sativa ci sono comunque tracce di avenoindoline mentre in tutte le specie diploidi o tetraploidi di Avena investigate queste proteine non sono state evidenziate. Le vromindoline si separano in due famiglie denominate Vin-A e Vin-B quando sottoposte ad elettroforesi in ambiente acido (A-PAGE), ciascuna costituita da tre componenti. Le vromindoline Vin-B1, Vin-B2 e VinB3 sono risultate a loro volta codificate dai geni Vinb-1, Vinb-2 e Vinb-3 ciascuno presente in due o tre copie. Le proteine Vin-A sono sintetizzate a partire dalla prima settimana dopo l’antesi, mentre le proteine Vin-B vengono sintetizzate ed accumulate con una settimana circa di ritardo. L’accumulo di Vin-A e Vin-B sui granuli d’amido prosegue per oltre 35 giorni dopo l’antesi. E’ risultato inoltre che la quantità di proteine Vin-A e Vin-B accumulate sui granuli di amido è particolarmente elevata pari a circa l’1,5% del peso secco della cariosside, 10 volte maggiore di quella osservata per le puroindoline di grano. L’amplificazione PCR con primer specifici per i geni vromindolinici ha dimostrato che il gene Vinb-2 non è esclusivo dell’avena ma è presente anche nel grano diploide T. monococcum con genoma Am e nel grano esaploide T. zhukovskyi con genoma AuAmG. Lo studio della natura biochimica e genetica delle vromindoline A ha portato alla scoperta del gene Aati codificante per una proteina di 150 aminoacidi altamente idrofobica denominata “Avena α-Amylase Trypsin Inhibitor” (AATI) e appartenente alla famiglia 2S. Al fine di dimostrare il ruolo svolto dalle vromindoline nel determinare la tessitura estremamente soffice delle cariossidi di avena, piante di grano duro cv. Svevo (indice di SKCS medio >90) sono state trasformate mediante il metodo biolistico usando due plasmidi contenenti il gene Vinb-2Xa o il gene Vinb-3Xa di avena. Ventiquattro piante T1 contenenti entrambi i transgeni sono state allevate in fitotrone, e caratterizzate per la loro struttura genetica e per la tessitura della cariosside. Le frequenze delle due classi fenotipiche per la presenza/assenza di entrambi i geni vromindolinici Vinb-2Xa e Vinb-3Xa nelle cariossidi T2 ottenute dalle piante G5 e G30, come determinato dall’amplificazione PCR con i primers specifici per le vromindoline, sono risultate molto vicine al rapporto 3:1, suggerendo che i due transgeni si comportano come un’unità mendeliana singola. La co-segregazione dei due transgeni è stata osservata anche nella progenie della pianta transgenica G29 ma in un rapporto di segregazione 15:1 caratteristico di due fattori epistatici non concatenati. Nelle progenie delle piante contenenti entrambi i transgeni vromindolinici sono state identificate cariossidi con valori di SKCS estremamente variabili, alcune delle quali con indici particolarmente bassi (<30) tipici di varietà a tessitura soft, fatto che suggerisce un effettivo ruolo delle vromindoline B nel determinare la tessitura soffice delle cariossidi di avena e in grado di modulare la durezza del chicco anche in grano duro.

Amongst the cereal crops, Avena sativa (hexaploid species with genome AACCDD), is characterized by an extremely soft endosperm texture with mean SKCS values around - 20, much lower than those measured in common wheat (14 to 90), rye and barley (40 to 60) and einkorn wheat (-5 to 0). This high softness causes some negative agronomic and technological aspects. The analysis of genetic, molecular and biochemical basis of soft texture of oats grain is the subject of the present PhD project. Kernel texture in common wheat is mainly controlled by puroindolines A (Pin-A) and B (Pin-B), which accumulate on starch granules in the endosperm. The observation that A. sativa contains DNA sequences similar to genes coding for wheat puroindolines, suggested that proteins (avenoindolines) encoded by these DNA sequences could play a role in determining kernel texture in oats. Therefore, proteins associated with starch granules in endosperm of hexaploid, tetraploid and diploid genotypes of Avena were analyzed by mono and two-dimensional electrophoresis, protein sequencing and immunochemical techniques (Western blotting). PCR amplification, RT-PCR, RACE and gene sequencing were also used to identify and characterize the genes coding for starch-bound proteins in those oats species. Evidence has been obtained that oats is the only cereal species with soft kernels in which puroindoline-like proteins (avenoindolines) do not play a significant role in the modulation of kernel texture, as suggested by the fact that avenoindolines occur in trace amounts in Avena sativa, whereas they are absent in all diploid and tetraploid Avena species analyzed. In oats species, the role of determinant factors of kernel texture seems to be played by proteins, called here vromindolines (vromi is the greek name for oats), which are characteristic of this species and absent in wheat. Vromindolines (Vin) were found to belong to the 2S protein family. They proved to be similar to puroindolines in their aminoacid sequences, number (10) and position of cysteine residues, basic isoelectric point, molecular weight (13-14 KDa) and the ability to accumulate on starch granules. However, vromindolines exhibit some peculiar characteristics such as a central domain with four tryptophan residues (instead of five or three typical of Pin-A and Pin-B, respectively), the presence of several charged amino acids at both ends of the mature protein, and insolubility in chloroform/methanol mixtures. When fractionated by acid electrophoresis (A-PAGE), vromindolines in diploid, tetraploid and hexaploid Avena species split into two families called Vin-A and Vin-B, each consisting of three major components (Vin-A1, Vin-A2, Vin-A3, Vin-B1, Vin-B2 and Vin-B3). Vromindolines Vin-B1, Vin-B2 and Vin-B3 are encoded by Vinb-1, Vinb-2 and Vinb-3 genes each present in two or three copies. Vin-A proteins are synthesized from 7 days post-anthesis (DPA), while Vin-B proteins are synthesized from 14 DPA. Accumulation of both Vin-A and Vin-B on starch granules continues for more than 35 DPA. Results also indicated that the amount of Vin-A and Vin-B accumulated on starch granules is particularly high, about the 1.5% of the dry weight of the kernel, at least 10 times greater than that observed for puroindolines in wheat. PCR amplifications with three primer pairs specific for genes coding for Vin-B1, Vin- B2 and Vin-B3 did not produce amplicons in barley, rye, common wheat, durum wheat and T. timopheevii. On the contrary, Am -genome T. monococcum ssp monococcum and hexaploid wheat T. zhukovskyi with AmAuG genomes were found to possess the Vinb-2Xa gene, suggesting a phylogenetic relationship between genome Am and the A genome in Avena species. Biochemical and genetic characterization of proteins associated to starch granules in A. sativa led to identification of a gene coding for a novel, highly hydrophobic protein, of 150 aminoacids, here called Avena-α Amilase-Trypsin–Inhibitor (AATI). In order to demonstrate the softening effect of vromindolines on oats kernel texture, durum wheat cv. Svevo (mean SKCS value >90 ) was transformed by the biolistic method using a pair of plasmids containing either Vinb-2Xa or Vinb-3Xa. Twenty-four T1 plants expressing both transgenes were grown in plant growth chambers, and characterized for their genetic structure and kernel texture. The frequencies of the two phenotypic classes for the presence/absence of both Vinb-2Xa and Vinb-3Xa genes in the T2 kernels obtained from transgenic durum wheat plants G5 and G30, as determined by PCR amplification of genomic DNAs with vromindoline-specific primers, were closed to the 3:1 ratio, suggesting that the two transgenes behaved as a single Mendelian unit. Co-segregation of Vinb-2Xa and Vinb- 3Xa was also observed in the progeny of transgenic plant G29. However, the segregation data for transgenes in the progeny of plant G29 was close to the 15:1 ratio for two independent Mendelian units. Mean SKCS values lower than 30, which are typical of soft kernels, were observed in the progeny of several T1 plants of cv. Svevo, suggesting that vromindolines Vin- B2 and Vin-B3 are responsible of the soft texture of oats kernels and are able to modulate grain texture in durum wheat as well.