http://http://dspace.unitus.it:80 The DSpace digital repository system captures, stores, indexes, preserves, and distributes digital research material. Fri, 24 May 2013 20:05:50 GMT 2013-05-24T20:05:50Z http://hdl.handle.net/2067/1199 Title: Reazioni cellulo-mediate in vitro e in vivo nella spigola (Dicentrarchus labrax) Authors: Zarletti, Gianpaolo Abstract: Il lavoro sperimentale effettuato in questa tesi di dottorato è consistito nello studio dell’attività di leucociti coinvolte in reazioni allogeniche, xeno geniche, di immunomodulazione mediante pratiche di vaccinazione, studio dell’espressione genica e produzione di un anticorpo anti CD8α. Nella prima fase sperimentale sono state studiate le reazioni di leucociti di sangue periferico (PBL) “in vitro” in risposta a stimolo allogenico derivante da PBL inattivati mediante irradiazione con raggi X nel teleosteo Dicentrarchus labrax (spigola). I risultati ottenuti mostrano un marcato incremento del numero dei linfociti T dopo 2 settimane di incubazione in reazioni unidirezionali di leucociti mescolati (MLR: mixed leukocyte reaction). Viceversa i linfociti B non sembrano essere coinvolti nella MLR in quanto i valori ottenuti sono paragonabili ai valori ottenuti dai PBL di controllo mantenuti in coltura senza alcuno stimolo. La proliferazione dei linfociti T è stata anche confermata mediante RT-PCR attraverso l’analisi dell’espressione dell’ mRNA per il recettore dei linfociti T (TCR: T-cell receptor β). Per contro è stato osservato un significativo decremento della proliferazione dei linfociti T mediante l’aggiunta di 5 μg/ml di ciclosporina A (CsA) alle colture di MLR. I leucociti prelevati dalle colture di MLR hanno mostrato un sensibile aumento dell’ attività citotossica rispetto ai campioni di controllo, questo dato suggerisce la presenza ed il coinvolgimento di linfociti citotossici (CTL) nelle reazioni di MLR. L’attivazione cellulare dei PBL in reazioni di MLR a 2 settimane di incubazione è stata determinata mediante l’analisi della mobilizzazione intracellulare di Ca2+ anticorpo-indotta misurata con Fura-2 AM. Con questa metodica si è osservato un aumento della mobilizzazione di Ca2+ intracellulare negli MLR mentre è diminuita con la presenza di CsA. Nella seconda fase sperimentale, invece, sono state studiate reazioni di citotossicità verso bersagli xenogenici e l’immunomodulazione derivante da vaccinazione. I risultati mostrano un coinvolgimento di linfociti T e B e per quanto riguarda i pesci sottoposti a vaccinazione si evidenzia una notevole produzione di immunoglobuline specifiche, ciò è stato anche evidenziato mediante lo studio dell’espressione genica dei geni coinvolti in tali reazioni. Mediante esperimenti di Real-time PCR sono stati studiati alcuni geni del sistema immunitario in vari organi emopoietici quali Timo, intestino (GUT), rene cefalico (HK), milza (Spleen) e sangue periferico (PBL). La scelta di effettuare indagini anche nell'intestino è maturata dal fatto che esso è il distratto anatomico in cui si denota una predominante espressione di geni associati ai linfociti T. I risultati mostrano una notevole presenza di geni correlati a cellule T nel timo e nell’intestino; ciò fa pensare che il sistema immunitario acquisito possa aver avuto ed avere importanti correlazioni con il sistema digerente. Dati preliminari ottenuti nel nostro laboratorio hanno dimostrato che che la popolazione T del GALT contiene cellule CD8α+, TCRγ+ e ciò suggerisce una similarità con il fenotipo cellulare IELs nei mammiferi. Il lavoro effettuato durante la tesi rappresenta una determinazione diretta e quantitativa di alcune attività delle cellule T e B “in vitro” in una specie di teleosteo. I dati ottenuti chiariscono per la prima volta in un modello piscino alcune attività cellulari legate alle risposte immunitarie e suggeriscono meccanismi conservati nell'evoluzione dei vertebrati. Description: Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellulare Mon, 15 Mar 2010 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/2067/1199 2010-03-15T23:00:00Z http://hdl.handle.net/2067/1685 Title: Cellular and molecular immune responses of the sea bass (Dicentrarchus labrax) experimentally infected with betanodavirus Authors: Scapigliati, Giuseppe; Buonocore, Francesco; Randelli, Elisa; Casani, Daniela; Meloni, Sabrina; Zarletti, Gianpaolo; Tiberi, M.; Pietretti, D.; Boschi, I.; Manchado, Manuel; Martin-Antonio, B.; Jimenez-Cantizano, R.; Bovo, Giuseppe; Borghesan, Fabio; Lorenzen, Niels; Einer-Jensen, Katja; Adams, S.; Thompson, K.; Alonso, C.; Béjar, Julia; Cano, Irene; Borrego, Juan J.; Alvarez, M.Carmen Abstract: Naïve sea bass juveniles (38.4 ± 4.5 g) were intraperitoneally infected with a sublethal dose of betanodavirus isolate 378/I03, followed after 43 days by a similar boosting. This infection resulted in an overall mortality of 7.6 %. At various intervals, sampling of fish tissues were performed to investigate: i) B and T lymphocyte content in organs and tissues; ii), proliferation of leucocytes re-stimulated in vitro with inactivated virus; iii) presence of serum antibody specific for betanodavirus; iv) expression of genes coding for the following immunoregulatory molecules involved in innate and acquired responses: IFN-1, Mx, IL-1, Cox-2; IL-10, TGF-, TCR, CD4, CD8, IgM, by using a quantitative PCR array system developed for sea bass. The obtained results showed a detectable increase of T cells and B cells in PBL during betanodavirus infection. Furthermore, leucocytes obtained from blood, head kidney, and gills showed a detectable in “vitro” increase in viability upon addition of inactivated viral particles, as determined by measuring intracellular ATP concentration. ELISA analysis of sera showed that exposure to nodavirus induced a low, but specific antibody titer measured 43 days after infection, despite the presence of measurable levels of natural antibody. Finally, a strong upregulation of genes coding for IFN-1, Mx, and IgM was identified after both infection and boosting. Interestingly, an upregulation of Cox-2 until boosting, and of TGF- and IL-10 after boosting was also observed, while the other tested genes did not show any significant variations with respect to mock-treated fish. Overall, our work represents a first comprehensive analysis of cellular and molecular immune parameters in a fish species exposed to a pathogenic virus. Description: L'articolo è disponibile sul sito dell'editore http://www.sciencedirect.com/ Fri, 31 Dec 2010 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/2067/1685 2010-12-31T23:00:00Z