http://http://dspace.unitus.it:80 The DSpace digital repository system captures, stores, indexes, preserves, and distributes digital research material. Sun, 26 May 2013 00:07:23 GMT 2013-05-26T00:07:23Z http://hdl.handle.net/2067/1982 Title: Functional genomics analyses of a DREB-related gene in durum wheat Authors: Latini, Arianna Abstract: Adverse environmental stresses, such as drought, cold and high salinity, have a strong influence on agricultural production. The study of the mechanisms involved in plant response and tolerance to these stresses represents a major challenge for plant scientists especially in light of foreseen global climate changes. Plant genomics research is beginning to provide detailed information related to the molecular mechanisms and crosstalks of the signalling pathways involved in the different kinds of abiotic stress response. Wheat, together with maize and rice, is the most important crop grown worldwide. Durum wheat is a minor crop, grown on only 8 to 10 % of all the wheat cultivated area, but it is better adapted to semiarid climates than bread wheat. Significant advances in understanding the molecular biology of this tetraploid species must be achieved to improve its tolerance to drought and other environmental insults and, actually, this PhD research work focuses on dehydration tolerance in durum wheat by means of functional genomics techniques. A number of genes have been described that respond to water stress at the transcriptional level and several cis- and trans-acting factors involved in the expression of dehydration-responsive genes, such as the DRE element (Dehydration Responsive Element) and the DREB factors (DRE-Binding factors), have been extensively dissected. In a previous study, my collaborators at ENEA Research Center (Rome, Italy) and I have isolated a DREB2-related gene in durum wheat, designated as TdDRF1 (Triticum durum Dehydration Responsive Factor 1), and established that it is expressed in response to dehydration. This gene produces three transcript variants, namely, TdDRF1.1, TdDRF1.2 and TdDRF1.3, through alternative splicing. The transcript isoforms TdDRF1.1 and TdDRF1.3 encode AP2 transcriptional activators and TdDRF1.2 encodes a putatively truncated protein, lacking the AP2 DNA-binding domain. The current work is composed of three experimental sections. In the fist section, I report the analysis of the expression profiles of the three TdDRF1 alternatively spliced transcripts upon dehydration, in four durum wheat and one triticale cultivars grown in greenhouse, and reveal that, even though these cultivars exhibit a very similar water retention in their leaves, their tolerance to dehydration may depend on a genotype-specific TdDRF1 expression pattern together with many other additional genotype-specific traits. Furthermore, the genetic variability of TdDRF1 sequences was explored among the five cultivars, in search of genotype-specific polymorphisms. In the second section, I describe a notable experimental work, that is still in progress, for assessing the expression profile of the TdDRF1 gene and its relation to the tolerance of durum wheat cultivars, grown under water stressed (reduced irrigation) and non-stressed (full irrigation) conditions at CIMMYT s experimental fields (Obregón, Mexico). Two groups of durum cultivars were chosen for this scope: one group exhibiting good drought tolerance and the other one exhibiting strong drought susceptibility. The TdDRF1 transcripts expression levels were monitored by real-time RT-PCR and results of one tolerant (Duilio) and one susceptible (Creso) cultivars are reported. While studying the TdDRF1 transcripts expression profile, dependent on the particular plant water status and on the genotype, many efforts have been concentrated to attempt clarify the function of the three gene products, for which no direct information is available in literature. In the third section, I describe an approach towards the investigation of the function of all the three gene products, using a heterologous overexpression system PVX (Potato Virus X)-mediated. Initially, the complete codifying sequences (CDSs) of the three TdDRF1 transcripts were isolated and cloned and, after that, the PVX-derived constructs for the transient overexpression in Nicotiana benthamiana and Nicotiana tabacum were engineered. An increased mRNA expression level, in comparison to wild type plants, was detected in all inoculated plants. The immediate next step will be the protein analysis with the double aim of isolating the target proteins produced in plant and investigating their molecular partners in the networks involved in the dehydration stress signalling and response. All the information and experimental data reported in this PhD work, as basic research, will be useful to enrich the actual knowledge about the molecular basis of drought stress and, possibly, they will draw together to a future application in molecular assisted breeding.; Condizioni ambientali avverse, come la siccità, il freddo e l'elevata salinità, esercitano un'influenza negativa sulla produttività agricola. Lo studio dei meccanismi coinvolti nella risposta e nella tolleranza della pianta a questi stress rappresenta una grande sfida per i ricercatori vegetali, soprattutto in visione dei cambiamenti climatici globali attesi. La ricerca genomica delle piante sta iniziando a fornire informazioni dettagliate sui meccanismi molecolari e le interazioni tra le vie segnaletiche coinvolte nei differenti tipi di risposta agli stress abiotici. Il grano, insieme al mais ed al riso, è il cereale più coltivato al mondo. Il grano duro è una coltivazione minore che rappresenta solo l'8-10 % di tutta l'area coltivato a grano, ma si adatta meglio ai climi semiaridi rispetto al grano tenero. Al fine di migliorare la sua tolleranza all'aridità e agli altri insulti ambientali, è necessario che vi siano avanzamenti significativi nella comprensione della biologia molecolare di questa specie tetraploide e, a questo proposito, il mio dottorato di ricerca si focalizza sullo studio della tolleranza alla disidratazione in grano duro per mezzo di tecniche di genomica funzionale. Sono stati descritti numerosi geni che rispondono allo stress idrico a livello trascrizionale e sono stati analizzati estensivamente dei fattori cis- e trans-agenti coinvolti nell'espressione dipendente da disidratazione, come l'elemento DRE (Elemento che Risponde alla Disidratazione) ed i fattori DREB. Durante uno studio precedente, i miei collaboratori presso il Centro Ricerche ENEACasaccia (Roma) ed io abbiamo isolato in grano duro un gene del tipo DREB2, chiamato TdDRF1 (Fattore 1 che Risponde alla Disidratazione in Triticum durum), e stabilito che la sua espressione viene modulata in condizioni di stress idrico. Questo gene produce tre tipi di trascritti per splicing alternativo: TdDRF1.1, TdDRF1.2 e TdDRF1.3. I trascritti TdDRF1.1 e TdDRF1.3 codificano per attivatori trascrizionali di tipo AP2, mentre il trascritto TdDRF1.2 codifica per una putativa proteina tronca priva del dominio di legame al DNA di tipo AP2. Questa Tesi di Dottorato è composta di tre sezioni sperimentali. Nella prima sezione riporto l'analisi dei profili di espressione dei tre trascritti alternativi del gene TdDRF1 durante disidratazione, in condizioni controllate di serra, di quattro coltivazioni di grano duro ed una di triticale. I risultati rivelano che, nonostante questi genotipi trattengano la stessa quantità d'acqua nei tessuti e pertanto siano similmente tolleranti, la loro tolleranza alla disidratazione può dipendere da un pattern di espressione genotipo-specifico del gene TdDRF1 oltre che da ulteriori caratteristiche specifiche sempre relative al genotipo. Inoltre, è stata esaminata la variabilità genetica presente nelle sequenze di TdDRF1 delle cinque varietà di frumento col fine di evidenziare dei polimorfismi genici genotipo-specifici. Nella seconda sezione descrivo un lavoro sperimentale di rilievo, ancora in corso, concepito per valutare il profilo di espressione del gene TdDRF1 e la sua relazione con la tolleranza alla siccità nelle coltivazioni di grano duro, cresciute sotto condizioni ottimali (irrigazione completa) e condizioni di stress idrico (irrigazione ridotta), presso i campi sperimentali del CIMMYT (Obregón, Messico). Due gruppi di genotipi di grano duro sono stati selezionati: un gruppo di arido-tolleranti ed un gruppo di arido-suscettibili. I livelli di espressione dei trascritti di TdDRF1 sono stati monitorati via real-time RT-PCR e vengono presentati i risultati conseguiti per una varietà tollerante (Duilio) ed una suscettibile (Creso). Parallelamente allo studio del profilo di espressione dei trascritti del gene TdDRF1, dipendente dal particolare stato idrico della pianta e dal genotipo, sono stati eseguiti degli esperimenti indirizzati al chiarimento della funzione di questi tre trascritti, dei quali in letteratura non è disponibile alcuna informazione diretta. In particolare, nella terza sezione, descrivo un approccio rilevare la funzione molecolare dei tre trascritti genici, avvalendosi di un sistema eterologo di over-espressione mediato dal virus X della patata (PVX). Il primo passo è stato l'isolamento ed il clonaggio delle sequenze codificanti complete (CDSs) per i tre trascritti TdDRF1; successivamente, sono stati ingegnerizzati i costrutti derivati dal PVX per l'over-espressione transiente in piante di Nicotiana benthamiana e Nicotiana tabacum. In tutte le piante infettate è stato rilevato un aumento degli mRNA dei trascritti, rispetto alle piante wild-type. Il passo immediatamente successivo sarà l'analisi delle proteine con il doppio scopo di isolare le proteine bersaglio prodotte in pianta e di determinare le molecole con cui queste interagiscono nelle reti coinvolte nella segnalazione dello stress idrico e nella conseguente riposta della pianta. Tutte queste informazioni ed i dati sperimentali riportati in questa Tesi di Dottorato sono utili come ricerca di base, arricchendo le attuali conoscenze sui meccanismi molecolari dello stress idrico e, possibilmente, gettano le basi per una futura applicazione nel miglioramento genetico assistito da marcatori molecolari. Description: Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellulare Thu, 03 Apr 2008 22:00:00 GMT http://hdl.handle.net/2067/1982 2008-04-03T22:00:00Z